陳海紅 甘燦云 楊海燕

浙江省杭州市中醫(yī)院 浙江 杭州 310007

清炎洗劑[1]是我院中醫(yī)婦科特色醫(yī)院制劑，全方由蛇床子、苦參、苦楝皮等6味中藥組成，經(jīng)煎煮、濃縮制成供婦科熏洗的洗劑，具有顯著的清熱燥濕、止癢殺蟲(chóng)功效，用于外陰炎，療效確切。按照臨床的要求，筆者將本處方開(kāi)發(fā)成凝膠劑，以方便使用。處方所含主要藥效活性成分為香豆素類、生物堿類、黃酮類、鞣質(zhì)、皂苷等。針對(duì)復(fù)方制劑成分復(fù)雜，且常常是多成分、多靶點(diǎn)綜合發(fā)揮作用的現(xiàn)實(shí)情況，筆者選用乙醇作為提取溶劑，并以君藥蛇床子中的蛇床子素、苦參堿提取量和出膏量為考察指標(biāo)，對(duì)清炎凝膠的提取工藝進(jìn)行考察，通過(guò)正交試驗(yàn)法優(yōu)選方中藥材提取工藝，以為該制劑的實(shí)際生產(chǎn)提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器：LC-20島津高效液相色譜儀系列，DHG9246A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），RE-200B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），KQ-400DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），XS105DR電子分析天平（梅特勒-托利多），BS224電子天平(賽多利斯)，DK-S24電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）

1.2 藥材、藥品與試劑：蛇床子、苦參、苦楝皮、白鮮皮、南鶴虱、重樓（浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司）；蛇床子素對(duì)照品(110822-200406)，苦參堿對(duì)照品(110805-200508)，以上對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純；試驗(yàn)用水為重蒸餾水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝：分述如下。

2.1.1 因素水平：在分析處方中各藥味所含主要成分的基礎(chǔ)上，用乙醇回流提取?？紤]到此法與傳統(tǒng)的水煎醇沉方法的利弊比較，為了極大地保存活性成分，擬采用含水乙醇回流提取的工藝路線，并選擇蛇床子指標(biāo)成分蛇床子素提取量、苦參指標(biāo)成分苦參堿提取量以及出膏率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、加醇量（B）、提取時(shí)間（C）、提取次數(shù)（D）為影響因素進(jìn)行優(yōu)化。因素水平見(jiàn)表1。

表1 因素水平表

2.1.2 試驗(yàn)方法[2]：按照處方比例稱取蛇床子（12g）、苦參（12g）等中藥飲片，置于提取回流裝置中，以不同體積分?jǐn)?shù)乙醇為提取溶劑，按正交試驗(yàn)條件進(jìn)行提取，提取液合并濾過(guò)，濾液回收乙醇濃縮后定容至100ml，共制得9份提取液，備用。

2.1.3 出膏率的測(cè)定[3]：精密吸取上述提取液各20ml，分別置于已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，于105℃干燥3h；移至干燥器中，冷卻30min，迅速精密稱定質(zhì)量，計(jì)算出膏率：出膏率＝[干膏質(zhì)量（g）/藥材總質(zhì)量（g）]×100%。

2.1.4 蛇床子素提取量測(cè)定：分述如下。

2.1.4.1 色譜條件[4-5]：色譜柱Agilent C18(150mm×4.6mm,5μm)，以乙腈-水(65∶35)為流動(dòng)相，流速為1.0ml/min，柱溫為25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為322nm；進(jìn)樣量：20μl。理論塔板數(shù)按蛇床子素計(jì)不低于3000，在此條件下蛇床子素與其它組分達(dá)到基線分離。

2.1.4.2 蛇床子素對(duì)照品貯備液的制備：精密稱取蛇床子素對(duì)照品10.10mg置25ml的容量瓶中，用乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得蛇床子素對(duì)照品貯備液。

2.1.4.3 供試品溶液的制備：取正交試驗(yàn)的浸膏樣各0.1g，精密稱定，加無(wú)水乙醇適量，超聲處理30min，定容至10ml，再精密量取2m1置10ml容量瓶中并加無(wú)水乙醇至刻度，搖勻、濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。測(cè)定法：分別精密吸取對(duì)照品溶液20μl，供試品溶液20μl，注入高效液相色譜儀，依法測(cè)定，即得。

2.1.4.4 線性關(guān)系考察：分別精密吸取蛇床子素對(duì)照品貯備液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml，置10ml容量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻得 20.2、40.4、60.6、80.8、101.0μg/ml的蛇床子素系列對(duì)照品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，分別精密吸取20μl注入液相色譜儀，以對(duì)照品濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，得回歸方程Y=77227X+62901(r=0.9999)，蛇床子素在20.2～101.0μg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.1.4.5 精密度試驗(yàn)：吸取蛇床子素對(duì)照品貯備液20μl，連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定。結(jié)果蛇床子素峰面積的RSD為0.053%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)：吸取同一供試品溶液20μl于1、2、3、4、5、6h進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果蛇床子素峰面積的RSD為0.32%（n=6），表明供試品溶液在6h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.4.7 重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品6份，同法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果蛇床子素峰面積的RSD為1.95%（n=6）。

2.1.5 苦參堿提取量測(cè)定：分述如下。

2.1.5.1 色譜條件[4]：色譜柱：Agilent ZOBAX NH2(150mm×4.6mm,5μm)；柱溫：25℃；流動(dòng)相：乙腈-無(wú)水乙醇-3%磷酸溶液(80∶10∶10)；流速：1m1/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：265nm；進(jìn)樣量：20μl。理論塔板數(shù)按苦參堿計(jì)不低于2000。在此色譜條件下，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相同的保留時(shí)間處有一色譜峰，并與其它組分能達(dá)到基線分離。

2.1.5.2 苦參堿對(duì)照品貯備液的制備：精密稱取苦參堿對(duì)照品約10.38mg，置25ml容量瓶中，加乙腈∶無(wú)水乙醇（80∶20）溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（每1ml含苦參堿0.4152mg）。

2.1.5.3 供試品溶液的制備：取正交試驗(yàn)的浸膏樣0.1g，精密稱定，加無(wú)水乙醇適量，經(jīng)過(guò)超聲處理30min，并用無(wú)水乙醇定容至10ml。再精密量取1ml置10ml容量瓶中并加無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻并濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。測(cè)定法：分別精密吸取對(duì)照品溶液20μl，供試品溶液20μl，注入高效液相色譜儀，依法測(cè)定，即得。

2.1.5.4 線性關(guān)系考察：分別精密吸取苦參堿對(duì)照品貯備液(0.4152mg/ml)0.5、1.0、2.0、4.0、8.0ml，置10ml容量瓶中，加乙腈∶無(wú)水乙醇（80∶20）稀釋至刻度，搖勻得 8.304、16.608、33.216、66.432、132.864μg/ml的苦參堿系列對(duì)照品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，分別精密吸取20μl注入液相色譜儀進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)，得回歸方程Y=13855X+39491（r=0.9997），苦 參 堿 在 8.304～132.864μg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.1.5.5 精密度試驗(yàn)：吸取苦參堿對(duì)照品貯備液20μl，連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定。結(jié)果蛇床子素峰面積的RSD為0.23%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.5.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)：吸取同一供試品溶液20μl于1、2、3、4、5、6h進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果苦參堿峰面積的RSD為1.32%（n=6），表明供試品溶液在6h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.5.7 重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品6份，同法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果苦參堿峰面積的RSD為2.15%（n=6）。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果表

2.1.6 正交試驗(yàn)及方差分析：按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表進(jìn)行回流提取，共得到9份提取液，按“2.1.3”“2.1.4”“2.1.5”項(xiàng)下方法測(cè)定蛇床子和苦參堿提取量以及出膏量，采用綜合評(píng)分法[6]，依據(jù)以上3個(gè)指標(biāo)的重要性，以確定苦參堿提取量權(quán)重0.4，蛇床子素提取量權(quán)重0.4，出膏率權(quán)重0.2；分別以蛇床子素提取量、苦參堿提取量及出膏量中最高測(cè)量值為滿分100，其他均通過(guò)與最高得分進(jìn)行換算。每項(xiàng)評(píng)分得分=單項(xiàng)測(cè)量值/單項(xiàng)最高值×權(quán)重分值，結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表3 方差分析表

由表可知，各因素對(duì)提取影響大小的順序?yàn)樘崛〈螖?shù)＞提取時(shí)間＞溶劑體積分?jǐn)?shù)＞溶劑量；提取次數(shù)對(duì)提取結(jié)果有顯著性的差異。綜合考慮實(shí)際生產(chǎn)中的成本和時(shí)間等因素，最終確定最佳工藝為A2B1C3D3，即加6倍量70%乙醇回流3次,每次2h。

2.2 提取工藝驗(yàn)證：按處方比例稱取蛇床子、苦參、苦楝皮、白鮮皮等中藥飲片，按上述最佳工藝提取藥材,即加濃度為70%乙醇6倍量，加熱回流提取3次，每次2小時(shí)。平行提取3份，并按“2.1.3”“2.1.4”“2.1.5”項(xiàng)下方法測(cè)定蛇床素、苦參堿提取量及出膏量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

由驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果可知，最佳工藝中，蛇床子素平均提取量為75.81mg/g，RSD為2.63%；苦參堿平均提取量為83.94mg/g，RSD為2.35%；平均出膏率為15.14%，RSD為2.26%（RSD＜3.00%，n＝3），表明此提取工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

中藥成方制劑中藥物組成成分復(fù)雜，其藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)是復(fù)方所含的全成分，而單一考察指標(biāo)所篩選出的中藥成方制劑提取工藝條件往往不夠全面，不能完全代表中藥成方制劑整體質(zhì)量的優(yōu)劣，故應(yīng)選擇多個(gè)藥效成分或指標(biāo)成分，同時(shí)出膏率也是一個(gè)重要指標(biāo)，它代表了其他未知或不便檢測(cè)的成分。本試驗(yàn)以蛇床子素提取量、苦參堿提取量、出膏率為指標(biāo)，考察清炎凝膠的回流提取工藝，具有更好的針對(duì)性。

清炎凝膠處方以蛇床子、苦參為主藥，苦參具有清熱燥濕、祛風(fēng)殺蟲(chóng)、利尿的作用，蛇床子溫腎壯陽(yáng)，外用燥濕殺蟲(chóng)，與其余4味藥合用，共奏清熱燥濕、止癢殺蟲(chóng)之功。本處方中藥材所含有效成分主要為生物堿、香豆素、揮發(fā)油、皂苷等，本試驗(yàn)采用含水乙醇回流的方法，最大限度地提取相應(yīng)的有效成分。筆者通過(guò)L9(34)正交試驗(yàn)研究，確定清炎凝膠最佳提取工藝為：選用6倍量70%乙醇提取3次，每次2小時(shí)。且驗(yàn)證試驗(yàn)表明該提取工藝穩(wěn)定可行，為以后大批量生產(chǎn)提供了基礎(chǔ)。