翟 玲,夏 雨,楊艷芳,吳和珍,劉焱文,尤朋濤

(湖北中醫(yī)藥大學 中藥資源與中藥化學湖北省重點實驗室,湖北 武漢430065)

鱉甲為鱉科動物鱉(Trionyx sinensisWiegmann)的背甲,具有滋陰潛陽、退熱除蒸、軟堅散結(jié)的作用?，F(xiàn)代研究顯示,鱉甲可預防或延緩早期肝纖維化的形成和發(fā)展[1],有抗肝纖維化以及抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等作用,近年來鱉甲的藥理研究也多集中在這些方面[2-3]。鱉甲富含多種常見的氨基酸[4],經(jīng)煎煮后,起負抑制效應的大分子蛋白變性成為小分子肽類物質(zhì)而發(fā)揮抑制肝星狀細胞增殖作用[5]。動物藥中蛋白、氨基酸的分析檢測是迅速提升動物藥研究水準和促進動物藥資源開發(fā)利用的不二捷徑[6],一種準確且恰當?shù)姆治龇椒ㄊ菍崿F(xiàn)這一途徑的前提。因此,探究測定鱉甲水溶性蛋白含量的方法對鱉甲藥材的質(zhì)量控制具有重要意義。當前有關(guān)鱉甲此方面的研究報道尚不多見。因此,本實驗對其展開了初步研究?，F(xiàn)代提取蛋白主要以有機溶劑和堿液為溶劑,產(chǎn)量雖高但對蛋白品質(zhì)影響較大[7-8],而鱉甲的臨床常用劑型為其水煎液。因此,本實驗以水為溶劑。2015版《中國藥典》共收載了6種測定蛋白含量的方法,其中Lowry(福林－酚試劑)法是蛋白中酪氨酸和色氨酸與試劑反應,受蛋白的氨基酸組成影響較大,雙縮脲法本身靈敏度小且樣品用量大,而本實驗需得到準確高效的測定方法,但鱉甲水溶液中蛋白的具體組成成分尚不確定。因此,本研究采用其他4種不同的測定方法進行定量分析,以期達到實驗目的。

1 材料

1.1 鱉甲飲片

鱉甲經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學吳和珍教授鑒定為鱉科動物鱉Trionyx sinensisWiegmann的背甲,經(jīng)質(zhì)量檢測,符合2015版《中國藥典》的規(guī)定。

1.2 儀器

千分之一電子天平(JA2003)：上海常衡電子科技有限公司；粉碎機(XL-04B)：廣州市旭朗機械設(shè)備有限公司；超聲儀(SK7200HP)：上?？茖С晝x器有限公司；旋蒸機(RE-2000)：上海亞榮生化儀器廠；酶標儀、紫外分光光度計(SPARK 10M)：瑞士帝肯貿(mào)易有限公司；凱氏定氮儀(K9801)：上海析達儀器有限公司。

1.3 化學試劑

氫氧化鈉、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、濃硫酸、溴甲酚綠－甲基紅指示劑、牛血清標準蛋白：國藥集團化學試劑有限公司；BCA試劑盒、考馬斯亮藍試劑：南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 樣品液制備

將鱉甲粉碎,過2號篩,精密稱取1.00 g鱉甲粉末,加水50 mL,超聲提取兩次,每次30 min,減壓抽濾,合并兩次濾液,經(jīng)濃縮后于50 mL的容量瓶定容置于4℃?zhèn)溆?。蛋白標準溶液：精密稱取2.00mg牛血清標準蛋白粉末溶于1 mL的水中。

2.2 試劑的配制

BCA工作液：按照BCA Reagent A：BCA Reagent B＝100∶1的比例混合后置于4℃?zhèn)溆谩？捡R斯亮藍顯色液：按照考馬斯亮藍儲備液∶雙蒸水＝1∶4的比例進行配制。

2.3 定量分析

2.3.1 凱氏定氮法 凱氏定氮法被國內(nèi)外視為法定的標準檢驗方法[9-10],可作為衡量其他的蛋白定量方法準確性的標準。其通過測定樣品中總氮的含量換算出樣品中蛋白含量,測定步驟依次為樣品的消化、蒸餾、吸收及滴定。樣品的消化：在消化瓶中加入10 mL樣品、0.2 g硫酸銅粉末、6 g硫酸鉀粉末、10 mL濃硫酸和沸石后于通風櫥中消化；蒸餾：將10mL消化好的消化液和10mL 30%的氫氧化鈉進行水蒸氣蒸餾；吸收：以溴甲酚綠－甲基紅為指示劑用2%的硼酸溶液吸收蒸餾出的氨；滴定：用0.025 mol/L硫酸標準溶液進行滴定吸收了氨的硼酸溶液[11]。以2 g/L的蛋白標準蛋白對凱氏定氮法進行校正,測定表1中3個不同濃度樣品溶液的蛋白含量,重復測定3次。見表2。

表1 凱氏定氮法測定蛋白含量的溶劑配加

2.3.2 考馬斯亮藍G-250染色法 考馬斯亮藍G-250染料與蛋白中的堿性氨基酸和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合,顏色發(fā)生改變,且最大光吸收由465nm變成595nm,符合比爾定律(Beer),根據(jù)試劑盒的說明書按表1將各組試液加入96孔板中,用酶標儀于595 nm處測定吸光度,并計算蛋白含量,實驗獨立重復3次。

表2 考馬斯亮藍G-250染色法測定蛋白含量的溶劑配加

蛋白濃度(g/L)＝(測定OD值－空白OD值)/(標準OD值－空白OD值)?標準品濃度(0.563 g/L)。

2.3.3 BCA法 BCA法蛋白定量的原理為二價銅離子(Cu2＋)在堿性條件下被蛋白的肽鍵還原成一價銅離子(Cu＋),還原后的銅離子濃度與溶液中所含蛋白濃度成正比。Bicinchonininc Acid與一價銅離子絡(luò)合形成的紫色復合物在562 nm處有強烈的吸光性。將蛋白標準溶液按表3稀釋,取不同濃度稀釋液各25μL分別加入96孔板中,每孔加入200μL工作液后立即混勻,37℃反應30 min后用酶標儀于562 nm波長處測定吸光度,重復測定3次。所得標準曲線見圖1。

表3 BCA法測定蛋白含量的標準曲線溶劑配加

圖1 BCA法標準曲線

求得吸光度y與濃度x(mg/mL)的回歸方程y＝0.907 5x＋0.036 66,相關(guān)系數(shù)r＝0.999。結(jié)果表明,蛋白濃度在0～2 mg/mL范圍內(nèi),樣品溶液吸光度與蛋白濃度呈良好線性關(guān)系。按表1配制樣品溶液后于562nm波長處測定吸光度,重復測定3次。

2.3.4 紫外吸收法 蛋白分子中,絡(luò)氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵,使蛋白具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收峰在280 nm處,樣品溶液吸光度與蛋白含量成正比,用紫外分光光度計測定得到標準曲線后,通過標準曲線可測定得到樣品溶液的蛋白濃度。按表4制作標準曲線,重復測定3次。所得標準曲線見圖2。

表4 紫外吸收法測定蛋白含量的標準曲線溶劑配加

圖2 紫外分光光度測定標準曲線

求得吸收度y與濃度x(mg/mL)的回歸方程y＝0.146 5x＋0.012 2,相關(guān)系數(shù)r＝0.991 7。結(jié)果表明,蛋白濃度在0～2mg/mL范圍內(nèi),樣品溶液吸光度與濃度呈良好線性關(guān)系。按表1配制樣品溶液后于280nm波長處測定吸光度,重復測定3次。

3 結(jié)果

3.1 凱氏定氮法對樣品的測定

測定用時8～10 h,消耗樣品量較多,操作步驟繁瑣,盡管凱氏定氮法結(jié)果準確可靠,但目前進行蛋白定量并不是首選。將凱氏定氮法所測得的結(jié)果作為參考值,其他蛋白定量法測定所得到的結(jié)果與其對比,在保證測定結(jié)果準確的前提下得到高效的測定鱉甲水溶性蛋白含量的測定方法。凱氏定氮法測定3個不同濃度樣品溶液中蛋白含量的結(jié)果見表5。

表5 凱氏定氮法測定樣品中蛋白含量結(jié)果

3.2 考馬斯亮藍G-250染色法對樣品的測定

考馬斯亮藍G-250染色法對樣品中蛋白含量的檢測結(jié)果及其測定結(jié)果與凱氏定氮法的測定結(jié)果間的偏差見表6。蛋白濃度＜0.5 mg/mL時偏差≈32%,蛋白濃度在0.5 mg/mL～1mg/mL范圍內(nèi)時偏差≈31%,蛋白濃度在1 mg/mL～1.5 mg/mL內(nèi)時偏差≈33%。此法測定用時5～10 min。相比凱氏定氮法,考馬斯亮藍G-250染色法測定用時短、消耗樣品少、對操作環(huán)境無特殊要求,兩種方法測定結(jié)果間的偏差＞30%。

表6 考馬斯亮藍G-250染色法測定樣品中蛋白含量結(jié)果

3.3 BCA法對樣品的測定

樣品按表1分組,通過BCA法測定,所得數(shù)據(jù)帶入標準回歸方程所得結(jié)果及其測定結(jié)果與凱氏定氮法的測定結(jié)果間的偏差見表7。蛋白濃度＜0.5 mg/mL時偏差≈16%,蛋白濃度在0.5 mg/mL～1 mg/mL范圍內(nèi)時偏差≈11%,蛋白濃度在1 mg/mL～1.5 mg/mL范圍內(nèi)時偏差＜5%。此法測定用時40～50 min,相比凱氏定氮法,BCA法測定用時短、消耗樣品少、操作簡單,測定結(jié)果與凱氏定氮法的測定結(jié)果間有較小的偏差。

表7 BCA法測定樣品中蛋白含量結(jié)果

3.4 紫外吸收法對樣品的測定

紫外吸收法于280nm波長處對樣品中蛋白含量的測定結(jié)果及其測定結(jié)果與凱氏定氮法的測定結(jié)果間的偏差見表8。蛋白濃度＜1.5 mg/mL時,偏差＞96%,且兩法測定結(jié)果間的偏差隨測定樣品溶液蛋白濃度的減小而增大。因此,紫外吸收法雖有測定快速、樣品消耗少、樣品可回收、操作環(huán)境無特殊限制的優(yōu)點,但不適于鱉甲水溶性蛋白含量的測定。

表8 紫外吸收法測定樣品中蛋白含量結(jié)果

4 討論

考馬斯亮藍G-250染色法、BCA測定法、紫外吸收法3種蛋白定量法都是根據(jù)一定波長下,樣品吸光度的改變與蛋白濃度有直接的關(guān)系,從而測定相應波長下樣品吸光度的變化值可計算出樣品中蛋白濃度。這3種方法都是快速測定蛋白含量的方法,且分別與凱氏定氮法對比：考馬斯亮藍G-250染色法消耗少量樣品,用時短,操作簡單,兩方法的測定結(jié)果差異大,原因可能是樣品中蛋白的堿性氨基酸殘基和芳香族氨基酸含量較少或與標準蛋白不同[12]；BCA測定法消耗少量樣品,用時極短,操作簡單,兩方法的測定結(jié)果相近,兩法測定結(jié)果存在較小差異原因可能是樣品液中所含少量的雜質(zhì)、鈣離子、脂質(zhì)[13]、EDTA[14]等；紫外吸收法測定的樣品可完全回收,用時短,操作簡單,兩方法的測定結(jié)果差異極大,原因可能是所測樣品中蛋白與標準蛋白中酪氨酸和色氨酸含量差異太大[15],且樣品溶液中含的雜質(zhì)較多。

BCA法測定蛋白含量所用的試劑單一、產(chǎn)生復合物穩(wěn)定、不受TritonX-100及SDS等表面活性劑的影響,影響因素少且靈敏,在近些年的研究中體現(xiàn)出其優(yōu)勢,有望替代最常用的Lowry法。本研究中BCA法測定結(jié)果與凱氏定氮法的測定結(jié)果間差異小,所以綜合以上,對比凱氏定氮法、考馬斯亮藍G-250染色法、紫外吸收法3種蛋白測定方法,當鱉甲水提溶液中所含成分尚不明確的情況下,比較適合用BCA法對鱉甲水提溶液中蛋白含量進行快速測定。目前鱉甲的活性成分尚未明確,可控指標難以統(tǒng)一,但在鱉甲化學成分及抗肝纖維化等研究中,鱉甲藥材中的蛋白、多肽、氨基酸則至關(guān)重要,因此,鱉甲蛋白含量及其測定方法在鱉甲質(zhì)量控制的研究中必不可少。對于以蛋白含量作為評價鱉甲藥材質(zhì)量的指標,通過BCA法測定其蛋白含量的具體標準仍需進一步深入研究。