南方圓 陳夢茜 陳洪雷

(1.武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室 武漢 430000；2.武漢市江夏區(qū)人民醫(yī)院胸外科 武漢 430000)

肺癌是世界上最普遍、最致命的惡性腫瘤[1]。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)被確認(rèn)為肺癌的主要類型，約占肺癌的85%，肺腺癌(lung adenocarcinoma, LUAD)是NSCLC最常見的亞型。盡管包括輔助化療和靶向治療在內(nèi)的多種方法都在加速改進(jìn)，但LUAD (15%)的5年相對生存率仍然很低[2]。因此，尋求新的治療策略對改善LUAD患者的預(yù)后至關(guān)重要。

免疫治療是一種刺激免疫系統(tǒng)對癌細(xì)胞反應(yīng)的治療方法，已成為傳統(tǒng)外科手術(shù)、放化療和分子靶向治療的重要手段之一。免疫檢查點(diǎn)療法是一種以調(diào)控通路為靶點(diǎn)，有效增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答的新策略[3]。CD28家族受體與B7家族配體的相互作用在免疫調(diào)控和癌癥發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。B7家族檢查點(diǎn)目前由10多個(gè)成員組成其中包括B7-H7/Human endogenous retrovirus-H long terminal repeat-associating protein 2(HHLA2)[4]，與其他B7家族檢查點(diǎn)不同的是，HHLA2只在人類中被檢測到，而在小鼠中沒有被發(fā)現(xiàn)[5]，HHLA2在正常組織中表達(dá)較少，而在各種人類惡性腫瘤中廣泛表達(dá)[6]。目前， HHLA2的生物學(xué)影響和臨床價(jià)值尚未完全探討，因此，本研究采用了免疫組化(immunohistochemistry, IHC)方法檢測HHLA2在LUAD及相應(yīng)的癌旁組織中的表達(dá)情況，評價(jià)其臨床病理特征的相關(guān)性，為免疫檢查點(diǎn)聯(lián)合治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1病人資料

本次研究共涉及肺腺癌組織74例。這些標(biāo)本來源于武漢大學(xué)中南醫(yī)院病理科檔案室，從2005年7月至2013年7月被診斷的肺癌患者標(biāo)本中取得，并有詳細(xì)的臨床資料，腫瘤按國際抗癌聯(lián)盟(UICC 2010)第7版TNM分級進(jìn)行細(xì)分，臨床病理特征如性別、年齡、吸煙史、生存狀態(tài)、腫瘤浸潤深度(T)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M)，見表1。本實(shí)驗(yàn)符合武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定并獲得批準(zhǔn)。

1.1.2組織芯片的構(gòu)建

本研究共構(gòu)建了兩個(gè)獨(dú)立的組織芯片(Tissue microarrays，TMAs)(肺腺癌)。兩名病理專家獨(dú)立篩選蘇木精-伊紅染色(HE)的切片，以驗(yàn)證肺腺癌和結(jié)直腸癌的診斷。每個(gè)樣本選擇最具代表性的腫瘤和非癌區(qū)域直徑為1.5mm的組織，排列后制成肺腺癌的石蠟塊，然后被切成4μm的切片。

1.1.3免疫組化檢測HHLA2蛋白的表達(dá)

4μm的組織芯片常規(guī)烤片、脫蠟和水化后，進(jìn)行抗原修復(fù)：采用檸檬酸鹽緩沖液微波修復(fù)，室溫自然冷卻30min，自來水沖洗，ddH2O清洗3×2min，TBST緩沖液洗滌3×2min；用免疫組化筆畫圈，然后滴加封閉液，室溫濕盒中孵育20min；根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，滴加用抗體稀釋液稀釋后的一抗(HHLA2 1:200，美國Abcam公司)，4°C濕盒孵育過夜；TBST緩沖液洗滌3×2min；滴加DAKO即用型二抗，然后放入37°C濕盒中孵育40min；TBST緩沖液洗滌3×2min；滴加DAB稀釋液(1∶50稀釋，DAKO公司)，顯微鏡觀察顯色情況，反應(yīng)充分后自來水沖洗終止顯色；蘇木素復(fù)染，自來水返藍(lán)，脫水，透明和封片，顯微鏡觀察評估并拍照保存。

1.1.4免疫組化染色結(jié)果判斷

根據(jù)陽性區(qū)域(Positive area，AP)和染色強(qiáng)度(Staining intensity，IS)，半定量法分別評價(jià)HHLA2在免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)。陽性區(qū)域被分為：0(AP:0%～5%)，1 (AP: 5%～25%)， 2 (AP:26%～50%)， 3 (AP:51%～75%)，4(AP:>75%)。染色強(qiáng)度被定義為：0(陰性)，1(弱)，2(中等)，3(強(qiáng))。HHLA2表達(dá)式計(jì)算基于方程：強(qiáng)度分布(intensity distribution，ID)=陽性區(qū)域(AP)×染色強(qiáng)度(IS)[2]。因此，高評分的標(biāo)準(zhǔn)為：在腫瘤細(xì)胞表達(dá)>9，在免疫細(xì)胞>1。

1.2統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS20.0進(jìn)行所有數(shù)據(jù)的分析。采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行分析HHLA2的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性，以P<0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1在肺腺癌中HHLA2的表達(dá)模式

本研究檢測到HHLA2在大多數(shù)人肺腺癌中廣泛表達(dá)，具有明顯的空間分布規(guī)律，HHLA2主要定位于腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，在腫瘤細(xì)胞中尤為明顯。在鄰近的癌旁組織中， HHLA2在肺組織的上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞中均有輕微表達(dá)。顯然，HHLA2在腫瘤組織中的免疫組化染色強(qiáng)度顯著高于癌旁組織(P<0.05)。根據(jù)診斷閾值，在肺腺癌組織中，HHLA2高表達(dá)于77.0%(n=57)的免疫細(xì)胞和14.9%(n=11)的腫瘤細(xì)胞中。

2.2HHLA2在肺腺癌中表達(dá)的臨床病理意義

采用了χ2檢驗(yàn)研究HHLA2表達(dá)與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系，在肺腺癌患者中，HHLA2在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)均無關(guān)(P>0.05)。

表1 HHLA2表達(dá)水平與肺腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

參數(shù)nHHLA2Low[n(%)]High[n(%)]P性別男4235(47.3)7(9.5)女3228(37.8)4(5.4)0.866年齡≤645751(68.9)6(8.1)>641712(16.2)5(6.8)0.055浸潤深度(T)T1,T26757(77.0)10(13.5)T3,T476(8.1)1(1.4)1.000淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N)N04740(54.1)7(9.5)N1,N22723(31.1)4(5.4)1.000TNM階段I,II4336(48.6)7(9.5)III3127(36.5)4(5.4)0.943吸煙史有3125(33.8)6(8.1)無4338(51.4)5(6.8)0.357

3 討論

癌癥是一個(gè)可怕的全球醫(yī)療負(fù)擔(dān)，預(yù)計(jì)2019年全球?qū)⒂谐^1,810萬例新確診癌癥病例和960萬例癌癥相關(guān)死亡病例。引人注目的是，肺癌、女性乳腺癌和結(jié)直腸癌是極其主要的惡性腫瘤，約占全球發(fā)病率和死亡率的1/3[1]。在過去的幾十年里，免疫檢查點(diǎn)療法顯著地改變了癌癥治療領(lǐng)域，就肺癌方面而言，美國FDA已經(jīng)批準(zhǔn)PD-1/PD-L1抑制劑作為一線或二線治療[7]。

隨著免疫檢查點(diǎn)療法被強(qiáng)調(diào)為癌癥患者的一種重要治療策略，人們對新增加免疫檢查點(diǎn)的興趣大大增加。作為最近被確定的B7家族檢查點(diǎn)，少數(shù)學(xué)者針對HHLA2及其在肺腺癌的免疫微環(huán)境中的作用進(jìn)行了研究。據(jù)報(bào)道，與在癌組織中廣泛表達(dá)不同，HHLA2在乳腺、腸道、胎盤、膽囊等正常組織中表達(dá)有限[6]。它在人單核細(xì)胞中表達(dá)，在B細(xì)胞中被誘導(dǎo)[8]。有研究已證實(shí)HHLA2可能通過與不同配體的相互作用來刺激或抑制T淋巴細(xì)胞的功能[6]。HHLA2可以減弱細(xì)胞因子的分泌，比如干擾素(interferon，IFN)-γ、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)-α、白介素(interleukin，IL)-5和IL-10等[5]。相反，HHLA2也可以通過依賴AKT磷酸化，與其中一個(gè)受體跨膜免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域2(TMIGD2)結(jié)合，共同刺激T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生[8]。

本研究評估了HHLA2在肺腺癌中的表達(dá)模式和臨床意義，結(jié)果表明，HHLA2在肺腺癌中的表達(dá)顯著高于非癌性肺組織。值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)HHLA2有不同的表達(dá)模式，其在肺腺癌的腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞中均呈陽性染色，而在免疫細(xì)胞中尤為明顯，但本研究并未發(fā)現(xiàn)HHLA2與肺腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，可能與病例數(shù)較少有關(guān)。另外，HHLA2被報(bào)道了可以通過與不同的配體結(jié)合而發(fā)揮共抑制和共刺激活性。HHLA2的過表達(dá)可導(dǎo)致骨肉瘤和乳腺癌患者生存質(zhì)量低下[6, 9]。但也有研究表明了HHLA2的共同刺激作用，其中HHLA2可以增強(qiáng)T細(xì)胞功能[8]，并對胃癌有良好的預(yù)后[10]。本研究認(rèn)為HHLA2是肺腺癌潛在的免疫治療靶點(diǎn)，可能具有克服抗PD-1/PD-L1免疫治療獲得性耐藥的潛力，進(jìn)一步的研究需要綜合評價(jià)HHLA2的腫瘤異質(zhì)性和免疫功能，以達(dá)到最佳的免疫檢查點(diǎn)治療效果。希望本研究能夠有助于進(jìn)一步探索針對這些B7家族檢查點(diǎn)的臨床試驗(yàn)，在設(shè)計(jì)最佳的聯(lián)合免疫治療方法中發(fā)揮重要作用。