李厚鋼 湖北省藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院 郭有愛(ài) 長(zhǎng)江職業(yè)學(xué)院

《全球癌癥報(bào)告 2014 》顯示，中國(guó)新增和死亡病例世界第一，每年約 250 萬(wàn)人死于癌癥（肝癌），占世界肝癌總死亡人數(shù)的 51%。由肝纖維化引起各種病因的慢性肝病導(dǎo)致患者中的 25%～ 40%最終惡化為肝硬化乃至肝癌。肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是指由各種致病因子所致肝內(nèi)結(jié)締組織中肝星狀細(xì)胞(HSC)增生導(dǎo)致肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過(guò)度沉淀的病理過(guò)程。肝纖維化細(xì)胞的特點(diǎn)：具有增殖性、纖維原性、可收縮性的肌成纖維樣細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)室前期研究證明肝纖維化的進(jìn)程是可逆的，但抗肝纖維化的作用機(jī)理未知。本實(shí)驗(yàn)旨在研究扶正化瘀膠囊抗肝纖維化的作用機(jī)理，為后續(xù)課題組對(duì)抗肝纖維化作用機(jī)理研究提供一定的依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 受試藥物及其配制方法

扶正化瘀膠囊：0.3g/粒，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20020073，批號(hào)：170109，上海黃海制藥有限責(zé)任公司。臨用前稱(chēng)取扶正化瘀藥物粉末0.2925g溶于10ml溫水中即得。

30%CCL4：CCL4溶液與食用油按照3:7的比例混勻。

秋水仙堿：0.5mg/粒，國(guó)藥準(zhǔn)字H20113208，批號(hào)：20161004，廣東彼迪藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。臨用前稱(chēng)取0.2mg溶于10ml純水中，即得。

0.9 %氯化鈉注射液：國(guó)藥準(zhǔn)字H20043320，批號(hào)：161224510，武漢福星生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)KM小鼠，雄性，共96只，體重18～20克，由武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK（鄂）2012-0013。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理環(huán)境

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)SPF級(jí)環(huán)境，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK（鄂）2014-0009。自由飲用凈化水，光照為12h明暗交替，溫度為22～24℃，相對(duì)濕度50～70%。

2 儀器與試劑

2.1 試劑

10%中性甲醛、四氯化碳均購(gòu)買(mǎi)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）堿性磷酸酶（ALP）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；食用油為金龍魚(yú)食用油。

2.2 儀器

石蠟切片機(jī)（Finesse E+，賽默飛世爾）；烤片機(jī)（High Capacity Dryer，賽默飛世爾）；包埋機(jī)（Histo Star，賽默飛世爾）；包埋盒打號(hào)機(jī)（Printmate 150，賽默飛世爾）；脫水機(jī)（Excelsior ES，賽默飛世爾）；動(dòng)物秤（DS-671，上海金山亭衡衡器有限公司）；倒置熒光顯微鏡（BX53，OLYMPUS）；全自動(dòng)生化分析儀（AU400，OLYMPUS）；臺(tái)式低溫高速離心機(jī)（3K15，德國(guó)SIGMA）。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 動(dòng)物分組與給藥

KM小鼠適應(yīng)環(huán)境5天后，按隨機(jī)數(shù)表法隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、扶正化瘀給藥組和秋水仙堿給藥組。除空白對(duì)照組給予0.9%氯化鈉注射液外，剩余小鼠均給予30%CCL4腹腔注射，造模與治療同時(shí)進(jìn)行，灌胃體積20ml/kg，每周2次，共計(jì)4周。

實(shí)驗(yàn)期滿(mǎn)，所有小鼠禁食不禁水12h，取血，分離血清并采集組織樣本。

3.2 一般情況觀(guān)察

觀(guān)察小鼠進(jìn)食、存活、活動(dòng)狀態(tài)、毛色光澤度、排便等情況。

3.3 病理形態(tài)觀(guān)察

蘇木精-伊紅染色（HE），觀(guān)察小鼠肝纖維化的程度，倒置熒光顯微鏡觀(guān)察肝組織切片的超微結(jié)構(gòu)。

從肝左葉中部切取厚度約2mm的肝組織，用10%中性甲醛固定。將固定好的肝組織依次放置于脫水機(jī)按照“70%乙醇3h，80%乙醇 2h，90%乙醇 2h，95%乙醇 2h，100%無(wú)水乙醇（Ⅰ）30min,100%無(wú)水乙醇（Ⅱ）30min，二甲苯（Ⅰ）20min，二甲苯（Ⅱ）20min”的設(shè)定程序進(jìn)行脫水，然后依次置于包埋機(jī)、包埋打號(hào)機(jī)中包埋染色、打號(hào)，于烤片機(jī)中烘干后用切片機(jī)切制厚度為5μm的切片。用Progres CapturePro2.8.8顯微圖像處理系統(tǒng)觀(guān)察并收集圖片，比較各組肝臟組織形態(tài)變化。

3.4 肝功能生化檢測(cè)

小鼠取血后室溫靜置1h，12000r/min，離心10min，分離血清，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）堿性磷酸酶（ALP）。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不同組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

5 結(jié)果

5.1 一般情況觀(guān)察

空白對(duì)照組，小鼠活動(dòng)正常，毛發(fā)有光澤，飲食量正常；模型組，小鼠活動(dòng)減少，精神萎靡，毛發(fā)無(wú)光澤，尿液黃色，大便稀溏，有腹瀉，飲食量減少，小鼠喜歡縮在角落里；扶正化瘀給藥組與秋水仙堿給藥組小鼠活動(dòng)程度、飲食量和毛發(fā)光澤程度均好于模型組；秋水仙堿給藥組小鼠給藥期間發(fā)生過(guò)小鼠廝打現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)期間，空白對(duì)照組小鼠無(wú)死亡，死亡率0%；模型對(duì)照組小鼠死亡9只，死亡率37.5%；扶正化瘀給藥組小鼠死亡2只，死亡率8.3%；秋水仙堿給藥組小鼠死亡9只，死亡率37.5%。為方便統(tǒng)計(jì)學(xué)統(tǒng)計(jì)，各組均取10只小鼠進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。

5.2 肝病理形態(tài)觀(guān)察

空白對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，肝細(xì)胞多呈單核，以中央靜脈為中心呈放射狀排列；肝纖維化模型組小鼠肝小葉有大量的炎性細(xì)胞；扶正化瘀給藥組和秋水仙堿給藥組與肝纖維化模型組相比，其纖維化程度明顯減輕，炎性細(xì)胞侵潤(rùn)程度減小，與空白對(duì)照組相比，其肝纖維化程度明顯增強(qiáng)，表現(xiàn)為肝細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞和有炎性細(xì)胞侵潤(rùn)；扶正化瘀給藥組與秋水仙堿給藥組肝纖維化程度相比較，秋水仙堿給藥組纖維化程度明顯減輕，表現(xiàn)為肝小葉結(jié)構(gòu)輕度紊亂、排列恢復(fù)。

圖1 HE染色（×40）

5.3 血清生化學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

血清生化學(xué)結(jié)果顯示（表1），肝纖維化模型組（CCL4組）較空白對(duì)照組ALT、AST、ALP值顯著升高（P＜0.05）；扶正化瘀給藥組和秋水仙堿給藥組與肝纖維化模型組相比ALT、AST、ALP值明顯下降，存在顯著差異（P＜0.05）；扶正化瘀給藥組與秋水仙堿給藥組的ALT、AST、ALP值相比雖然低但不存在顯著差異，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

表1 血清生化學(xué)指標(biāo)

6 討論

本實(shí)驗(yàn)采用30%CCL4制備小鼠肝纖維化模型， CCL4模型是一種典型的制備肝纖維化模型方法，具有耗時(shí)短的特點(diǎn)。造模成功后可見(jiàn)肝細(xì)胞以及血清生化指標(biāo)發(fā)生顯著變化，ALT、AST、ALP是用于反映肝功能損傷或健康程度的基本指標(biāo)，大量文獻(xiàn)中使用ALT、AST、ALP的頻率遠(yuǎn)高于其他指標(biāo)。

有文獻(xiàn)將體重或肝指數(shù)作為檢測(cè)指標(biāo)，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，CCL4與油混用后，經(jīng)過(guò)腹腔注射、皮下注射和灌胃后，油的成分均有滯留在動(dòng)物體內(nèi)的現(xiàn)象，使動(dòng)物體重不同程度的增加。因此，我們認(rèn)為將體重或肝指數(shù)作為檢測(cè)指測(cè)指標(biāo)不具有研究意義。

有文獻(xiàn)報(bào)道小鼠肝纖維化模型制備后，存在一定的自愈傾向。為了驗(yàn)證這一結(jié)論，我們額外增加了一項(xiàng)預(yù)實(shí)驗(yàn)，另取18只KM小鼠，分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組和自愈組，空白對(duì)照組給0.9%氯化鈉，模型對(duì)照組給30%CCL4，除自愈組在第4周末次給藥后保留外，剩余兩組全部處死，取肝組織固定保存，自愈組每繼續(xù)經(jīng)過(guò)1周處死一只，觀(guān)察肝組織形態(tài)變化。發(fā)現(xiàn)在制備模型成功后，肝纖維化小鼠存在極弱的自愈能力，小鼠的肝組織形態(tài)幾乎無(wú)變化。

秋水仙堿作為西藥中的合成藥物，作用見(jiàn)效快，但死亡率高，不利于肝纖維化治療的用藥安全。中藥是以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，按中醫(yī)治療原則使用的貨真質(zhì)優(yōu)的藥材，包括中藥材、中藥飲片和中成藥。隨著中醫(yī)、針灸在西方世界的發(fā)展,中藥也受到了青睞。相對(duì)于毒副作用高的西藥，中藥毒副作用小、開(kāi)發(fā)潛力巨大，但其作用機(jī)理的闡明仍需繼續(xù)研究。