王新斌 薛國忠 陳威辛 戴恩來

激素抵抗型腎病綜合征是一種常見的多因素所致的病癥，作為腎病綜合征事件的高危因素，常易發(fā)展為終末期腎病而危及患者的生命[1]。近年來隨著基因診斷技術(shù)的突飛猛進(jìn)，越來越多的研究表明SRNS本質(zhì)是足細(xì)胞相關(guān)蛋白基因突變所致[2]。Nephrin、Podocin是近年發(fā)現(xiàn)的SD蛋白組分，已研究顯示其蛋白的表達(dá)或分布異常是蛋白尿形成機(jī)制中的關(guān)鍵因素[3,4]。中醫(yī)認(rèn)為SRNS發(fā)病的主要原因是脾腎陽虛，依據(jù) “益火之源，以消陰翳”理論，我們研究團(tuán)隊(duì)前期采用右歸丸治療激素抵抗型腎病綜合征患者取得滿意的療效[5,6]。本研究通過復(fù)制非免疫因素介導(dǎo)的阿霉素所致激素抵抗型腎病綜合征，探討右歸丸在SRNS中的增敏作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級Wistar大鼠60只，雄性，體質(zhì)量(180±20)g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號：6200100000025，許可證號：SCXK(甘)2015-0002。動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF實(shí)驗(yàn)中心，室溫22℃，輻照滅菌SPF級大鼠飼料喂養(yǎng)，給藥前禁食12 h，自由飲水。

1.2 藥物阿霉素(AD，Solarbio，批號111C024，規(guī)格:25 mg/支)；醋酸潑尼松片(浙江仙據(jù)制藥股份有限公司，批號140146，規(guī)格：5 mg/片)；右歸丸(北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，國藥準(zhǔn)字號Z11021040，規(guī)格：9 g/丸)。

1.3 主要試劑及儀器肌酐檢測試劑盒(批號：YZB/GER2659-2018)，尿素氮檢測試劑盒(批號：YZB/GER0315-2018)，總蛋白檢測試劑盒(批號： YZB/GER3253-2018)，白蛋白檢測試劑盒(批號：YZB/GER1029-2018)，三酰甘油檢測試劑盒(批號：YZB/GER5264-2018)，膽固醇檢測試劑盒(批號：YZB/GER1324-2018)，以上均由Roche Diagnostics Gmbh公司提供；全自動(dòng)生化分析儀(羅氏公司，型號COBASC701)；熒光顯微鏡(上海光學(xué)儀器廠，型號XSP-63XDV)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組與給藥60只雄性SPF級Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組(10只)和造模組(50只)。參照文獻(xiàn)[7]，造模組大鼠一次性尾靜脈注射阿霉素(6 mg/kg)建立激素抵抗型腎病綜合征大鼠模型，造模成功后采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組，激素組，激素中藥高、中、低劑量組，正常組大鼠注射等劑量生理鹽水。2周后，依據(jù)人與大鼠用藥量換算方法計(jì)算用藥量[8]分別灌胃給藥，正常組、模型組給予等體積生理鹽水灌胃，激素組給予潑尼松片混懸液灌胃，劑量為6.3 mg/(kg·d)；激素聯(lián)合中藥高、中、低組給予潑尼松混合右歸丸的混懸液灌胃,劑量分別為6.3/11.6 mg·kg-1·d-1、6.3/5.6 mg·kg-1·d-1、6.3/2.8 mg·kg-1·d-1，連續(xù)6周。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 生化指標(biāo)檢測末次給藥24 h后，將禁食不禁水16 h的動(dòng)物用10%水合氯醛溶液以0.3～0.4 ml/100 mg腹腔注射，麻醉后心臟采血，用生化管收集血液6～8 ml，靜置2 h后離心。全自動(dòng)生化儀檢測大鼠血清肌酐、尿素氮、總蛋白、白蛋白、總膽固醇、三酰甘油，24 h蛋白定量采用鄰苯三酚紅/鉬酸鹽比色法。

1.5.2 腎組織Nephrin、Podocin免疫熒光染色固定的腎組織經(jīng)常規(guī)洗滌、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片后行免疫組化法分析相關(guān)蛋白表達(dá)，染色熒光顯微鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 用藥前后各組大鼠尿蛋白定量比較造模前24 h尿蛋白測定結(jié)果顯示，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P>0.05，具有可比性。至第2周出現(xiàn)大量尿蛋白，當(dāng)24 h尿蛋白定量>100 mg/kg表明造模成功。除空白組外，其他各組用藥前24 h尿蛋白量比較，P>0.05；用藥前后24 h尿蛋白量比較，模型組顯著增加，除潑尼松組外，各治療組均顯著下降，用藥后與模型組比較，P>0.05；激素中藥組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。治療6周后，激素中藥組24 h尿蛋白量顯著下降(P<0.05)，各治療組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2 各組大鼠生化指標(biāo)比較與空白組比較，模型組TP與ALB水平顯著下降(P<0.05)，總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、肌酐(Scr)與尿素氮(BUN)明顯升高(P<0.05)。提示造模后，AD大鼠體內(nèi)蛋白流失較為明顯，脂質(zhì)代謝紊亂，腎功能損傷；與模型組比較，各中藥治療組TP與ALB水平顯著上升(P<0.05),TC、TG、Scr與BUN明顯下降(P<0.05)，潑尼松組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。表明右歸丸對激素抵抗型腎病綜合征大鼠模型各生理指標(biāo)的恢復(fù)和改善治療明顯，且高中低劑量組無明顯差異(P>0.05)，表明治療效果無劑效關(guān)系。見表2。

表1 各組大鼠用藥前后尿蛋白定量變化情況 (只，

注：與空白組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05；與潑尼松組比較，3)P<0.05

表2 各組大鼠總蛋白、白蛋白及血脂的變化情況 (只，

注：與空白組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05；與潑尼松組比較，3)P<0.05

2.3 各組大鼠Nephrin、Podocin的表達(dá)免疫熒光染色可見，與空白組比較，其他各組Nephrin、Podocin熒光表達(dá)均降低(P<0.05)；與模型組相比較，除激素組外其他各組熒光部分恢復(fù)，其表達(dá)優(yōu)于模型組(P<0.05)；激素中藥高劑量組Nephrin、Podocin熒光表達(dá)高于中、低劑量組，具有明顯的量效關(guān)系。見圖1、圖2。

圖1 Nephrin免疫組化結(jié)果(×200)

圖2 Podocin免疫組化結(jié)果(×200)

3 討論

激素抵抗型腎病綜合征(steroid-resistant nephrotic syndrome，SRNS)是指經(jīng)規(guī)范化激素治療無效的腎病綜合征，屬于難治性腎病綜合征(refractory nephrotic syndrome，RNS)的一種類型[9]， 是臨床慢性腎臟病中治療最為棘手，預(yù)后較差的病種。尾靜脈一次性注射阿霉素復(fù)制腎病綜合征模型，已廣泛應(yīng)用于中藥及其主要成分對腎臟保護(hù)作用的藥物篩選[10]。SRNS在病理上以微小病變(MCD)、系膜增生性腎小球腎炎(MesPGN)及局灶階段型腎小球硬化(FSGS)較為常見[11]。本研究采用此方法造模后，模型組大鼠在造模2周后出現(xiàn)大量的蛋白尿，生化指標(biāo)變化明顯，腎臟組織病理出現(xiàn)FSGS征象，表明實(shí)驗(yàn)成功建立了SRNS大鼠模型。

蛋白尿是CKD進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，足細(xì)胞的損傷是導(dǎo)致蛋白尿的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，同時(shí)大量的研究發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞相關(guān)蛋白基因的突變是激素抵抗型腎病綜合征的本質(zhì)。足細(xì)胞裂孔隔膜(slit diaphragm，SD)是覆蓋于足突裂隙間一層拉鏈樣膜狀電子致密結(jié)構(gòu)，其不僅是血漿蛋白濾過的主要分子屏障，裂孔隔膜相關(guān)蛋白亦作為一個(gè)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)平臺參與足細(xì)胞正常生理功能調(diào)節(jié)[12]。而足細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能的異常及損傷與足細(xì)胞裂孔隔膜蛋白“Nephrin、Podocin、CD2AP”表達(dá)異常密切相關(guān)。在病理?xiàng)l件下，裂孔隔膜信號平臺的關(guān)鍵分子異常表達(dá)，最終導(dǎo)致激素抵抗型腎病綜合征的發(fā)生。Nephrin、Podocin、CD2AP相互作用所形成的分子鏈可能是SD的功能單位，與蛋白尿有直接的關(guān)系；調(diào)控Nephrin、Podocin、CD2AP表達(dá)，就可以改善SD結(jié)構(gòu)，減少蛋白尿，降低SRNS這一事件的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)中，給藥6周后模型組Nephrin、Podocin的表達(dá)量明顯減少，各治療組除激素組外其他各組Nephrin、Podocin的分布部分恢復(fù)，表達(dá)高于模型組，且24 h尿蛋白定量、血脂、腎功能改變顯著。由此可見，Nephrin、podocin的表達(dá)變化與SRNS大鼠尿蛋白的形成有一定的關(guān)系。右歸丸是明代醫(yī)家張景岳根據(jù)《難經(jīng)·三十六難》中“左腎，右命門”的理論而創(chuàng)制，因右腎屬火主陽，故“右歸””是“溫陽補(bǔ)腎，使元陽得歸其原”之義。導(dǎo)師戴恩來教授在中藥對SRNS增敏研究中發(fā)現(xiàn)腎病綜合征中醫(yī)辨證為脾腎陽虛證的患者，且在運(yùn)用激素治療的過程中陽虛證候不易改善者，療效較差，而當(dāng)輔以溫補(bǔ)腎陽藥物時(shí)，患者對激素的敏感性明顯增強(qiáng)[13]。同時(shí)臨床發(fā)現(xiàn)運(yùn)用右歸丸能降低患者耐藥基因MDR1、P-gp170的表達(dá)、上調(diào)GRα的表達(dá)，從而增加SRNS患者對糖皮質(zhì)激素的敏感性。本研究中右歸丸聯(lián)合潑尼松組的相關(guān)指標(biāo)明顯優(yōu)于激素組，由此可見，采用中西醫(yī)雙重診斷，中西病癥結(jié)合模式能有效改善諸多臨床癥狀。

通過實(shí)驗(yàn)可見，右歸丸聯(lián)合激素可以緩解AD誘導(dǎo)的SRNS大鼠病變進(jìn)程，它能有效提升血清總蛋白、白蛋白，降低24 h尿蛋白、血肌酐和血尿素氮，促進(jìn)足細(xì)胞裂孔膈膜功能的修復(fù)，保持Nephrin、Podocin表達(dá)的完整性。我們推斷，右歸丸對激素的增敏作用，可能是保護(hù)腎臟，延緩SRNS進(jìn)展的作用機(jī)制之一。