任春霞，夏小艾，楊樹東，呂 蓓，童國慶

1.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，上海 200120；

2.無錫市人民醫(yī)院婦產科，江蘇 無錫 214023；

3.無錫市人民醫(yī)院病理科，江蘇 無錫 214023

上皮性卵巢癌是常見的致命性婦科腫瘤，占惡性卵巢瘤的70%以上，根據(jù)其分子特征可分為不同的亞型。高級別漿液癌通常含有TP53突變和（或）BRCA1或BRCA2突變［1］；低級別漿液癌常表現(xiàn)為KRAS和BRAF基因的激活和突變［2-3］；低級別子宮內膜樣癌與β-連環(huán)蛋白基因的突變有關［4］；黏液癌經常攜帶KRAS突變［5］。上皮性卵巢癌的一個分子亞型涉及BRCA1的種系突變，包括插入和缺失、移碼、堿基替換等突變，這些BRCA1突變在所有上皮性卵巢癌中占10%～15%［6-7］；而到70歲時，卵巢癌的患病風險增加到36%～66%［8-9］。BRCA1屬于腫瘤抑制基因，與許多其他腫瘤抑制因子一樣，BRCA1編碼一種控制基因轉錄、DNA損傷修復、同源重組、染色體穩(wěn)定性、細胞周期檢查點、泛素化和中心體復制的蛋白質［10］。具有BRCA1種系突變的遺傳性乳腺癌具有不同于散發(fā)性乳腺癌的形態(tài)和基因特征［11-12］；相反，具有BRCA1種系突變的卵巢癌與散發(fā)性乳腺癌難以區(qū)分［13-15］。 同樣，具有功能性BRCA1或BRCA2的高級別漿液性卵巢癌在組織學上與這些蛋白功能失活的同級別腫瘤難以區(qū)分。然而，突變的BRCA1如何導致卵巢癌發(fā)生尚不明確。本研究從1例攜帶BRCA1等位基因185delAG突變的患者身上分離和建立了一株卵巢表面上皮細胞系OSE236，并聯(lián)合使用p53 shRNA與人端粒酶反轉錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）催化亞基使其永生化，永生化細胞進一步導入致癌基因HRAS但未獲得體內和體外惡性轉化。本研究對該系列細胞系進行了BRCA1突變、細胞衰老、細胞周期及其相關蛋白的檢測分析，該細胞模型可能對研究遺傳性BRCA1突變相關卵巢癌和乳腺癌的發(fā)生和診治具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 細胞系構建、培養(yǎng)和質粒

本課題組于2015年為無錫市人民醫(yī)院收治的1例年齡為41歲的宮頸癌Ⅱb期漢族女性患者實施子宮全切手術，同時獲得手術切除的卵巢組織，經過病理學檢測為正常組織，組織的使用經過無錫市人民醫(yī)院倫理委員會批準，并與患者簽署組織使用知情同意書?；颊呓涍^基因篩查發(fā)現(xiàn)攜帶BRCA1單等位基因185delAG的遺傳性突變。我們采用已報道的研究方法［16］，從卵巢組織中分離和構建了正常卵巢表面上皮細胞系OSE236。然后使用已發(fā)表的技術方 法［17］，將靶向p53的shRNA導入OSE236細胞，構建了OSE236/p53i細胞系，繼之將hTERT催化亞基導入OSE236/p53i細胞，構建了OSE236/p53i/hTERT細胞系，隨后將致癌基因HRAS導入OSE236/p53i/hTERT細胞中，構建了OSE236/p53i/hTERT/HRAS細胞系。p53 shRNA和hTERT cDNA的導入均使用反轉錄病毒感染的方法介 導［18］。所用質粒p53 shRNA、hTERT和HRAS以及卵巢癌細胞系HEY來自復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院楊恭教授課題組，并在相關文獻中有描述［17］。卵巢癌細胞系HEY作為以下相關實驗的陽性對照。

1.2 細胞增殖測定

用細胞計數(shù)法測定每個細胞系中細胞的增殖。將1×104個細胞接種到12孔板中，每孔活細胞每隔1天計數(shù)1次，共6次。每株細胞培養(yǎng)3份，實驗重復3次。統(tǒng)計3次結果取平均值。

1.3 衰老相關β-半乳糖苷酶(senescenceassociated β-galactosidase，SA-β-gal）染色

SA-β-gal活性染色根據(jù)已報道的方法進行［16］。將25%～85%密度培養(yǎng)的細胞用PBS洗滌，并在室溫下用固定緩沖液（含2%甲醛和0.2%戊二醛的PBS）固定4 min。然后，在37 ℃的黑暗環(huán)境中，用檸檬酸/磷酸鹽緩沖液 ［0.15 mol/L NaCl、0.02 mol/L MgCl2、1 mg/mL X-gal、0.005 mol/L鐵氰化鉀和0.001 6 mol/L檸檬酸（pH=6.0）］洗滌細胞并溫育2～5 h。細胞質藍染顯示細胞衰老狀態(tài)。

1.4 細胞系基因組中BRCA1突變位點測序分析

根據(jù)已有報道［19］設計和合成PCR引物（購自蘇州金唯智生物科技有限公司），利用細胞基因組DNA小提試劑盒［DP304-02，購自天根生化科技（北京）有限公司］提取，PCR反應條件為95 ℃ 4 min，然后94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s， 72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)，最后72 ℃ 10 min延伸，樣品直接送蘇州金唯智生物科技有限公司 測序。

1.5 細胞周期測定

將細胞培養(yǎng)至75%的密度，胰酶消化收獲、PBS洗滌離心后加入10倍體積的75%乙醇（每個細胞系105個細胞），4 ℃固定細胞48 h以上，然后離心洗滌，再用1%碘化丙啶染色，使用配備CellQuest軟件的FACStation（購自美國BD公司）進行分析［18］。

1.6 蛋白質印跡法（Western blot）

利用RIPA緩沖液制備全細胞裂解物［18］。使用Bio-Rad蛋白質分析試劑盒（5000201）測量蛋白質濃度。HRAS（小鼠抗人單克隆抗體，sc-53959）、CDK4（小鼠抗人單克隆抗體，sc-23896）、cyclin B1（小鼠抗人單克隆抗體，sc-7393）、cyclin D1（小鼠抗人單克隆抗體，sc-8396）和cyclin E（小鼠抗人單克隆抗體，sc-248）購自美國Santa Cruz公司。β-肌動蛋白抗體（兔抗人單克隆抗體，#4970）購自美國Cell Signaling Technology公司。BRCA1抗體（鼠抗人單克隆抗體，MAB22101）購自美國R&D System公司。二抗為羊抗兔多克?。?074S，購自美國Cell Signaling Technology公司）或羊抗鼠多克隆（AS003，購自武漢愛博泰克生物科技有限公司）抗體并偶聯(lián)了辣根過氧化物酶（HRP）。蛋白條帶用辣根過氧化物酶底物偶聯(lián)的發(fā)光液（購自美國Millipore Corporation公司）顯色，并用E-Gel成像儀（購自上海天能科技有限公司）曝光。

1.7 軟瓊脂克隆形成實驗

軟瓊脂實驗是測定細胞在體外是否具有轉化癌細胞能力的研究技術，本研究參考已發(fā)表的方 法［17］，在60 mm培養(yǎng)皿中接種5×104個細胞進行軟瓊脂實驗分析。在顯微鏡下觀察和統(tǒng)計含有100個細胞以上的克隆數(shù)。卵巢癌細胞系HEY作為陽性對照。實驗重復3次，統(tǒng)計3次結果取平 均值。

1.8 BALB/c裸小鼠移植瘤實驗

為了檢測腫瘤的形成，我們將細胞單次皮下注射于4～6周大的BALB/c雌性裸鼠。動物實驗只接種OSE236/p53i/hTERT/HRAS細胞，設計6只小鼠，每只小鼠背部皮下接種1個點，每個點接種5×106個細胞。將小鼠置于無特定病原體環(huán)境中，每3 d觀察1次可見腫瘤生長情況。記錄第1個肉眼可見腫瘤出現(xiàn)的日期，此后每3 d用電子游標卡尺測量1次最大和最小腫瘤直徑。卵巢癌細胞系HEY作為陽性對照進行類似接種。腫瘤體積按a（最大直徑）×b（最小直徑）×0.52的公式計算。對照細胞腫瘤生長最大直徑超過2 cm時全部處死本組動物，而OSE236/p53i/hTERT/HRAS細胞接種的動物觀察3～5個月。動物實驗根據(jù)上海中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準的方案進行。

1.9 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 p53 shRNA與hTERT聯(lián)合誘導細胞永生化

卵巢表面上皮細胞OSE326的分離、培養(yǎng)和永生化參見高雯等［16］報道的技術方法。親代細胞（OSE236）在第10代后顯示出進入衰老的跡象，而表達p53 shRNA和hTERT（OSE236/p53i/hTERT）的細胞經過100次傳代并沒有衰老，細胞用p53 shRNA和hTERT永生化后，SA-β-gal的活性明顯降低，因此認為該細胞系在形態(tài)學和生理學上已被永生化（圖1A～B）。與OSE236和OSE236/p53i細胞相比，永生化OSE236/p53i/hTERT細胞的增殖顯著增加（P＜0.01），但在將HRAS導入OSE236/p53i/hTERT細胞后，細胞增殖沒有明顯增加（圖1C）。通過細胞基因組DNA測序分析，在OSE236細胞及其衍生細胞系中，證實BRCA1 185delAG突變位于BRCA1外顯子2中（圖1D）。

圖 1 聯(lián)合引入p53 shRNA與hTERT建立了永生化BRCA1 185delAG突變細胞系Fig. 1 Establishment of an immortalized cell line carrying BRCA1 185delAG mutation by the combined introduction of p53 shRNA and hTERT cDNA

2.2 永生化細胞中細胞周期及相關蛋白水平 檢測

與親代細胞相比，敲低p53的細胞（OSE236/p53i、OSE236/p53i/hTERT和OSE236/p53i/hTERT/HRAS）具有降低的G0/G1細胞群和升高的S期細胞群（圖2A～B）。Western blot分析顯示，細胞周期調節(jié)蛋白包括細胞周期蛋白B1、D1和E，以及細胞周期依賴性激酶CDK4，在p53 shRNA處理后顯著改變（圖2C）。與其親代細胞相比，OSE236/p53i、OSE326/p53i/hTERT和OSE236/p53i/hTERT/HRAS細胞中的周期蛋白CDK4、cyclin B1、cyclin D1和cyclin E顯著增加，而CDK4、cyclin D1和cyclin E在HRAS導入細胞中有所下降，表明HRAS表達有可能抑制了細胞周期進展。同時在親代細胞中檢測到p53的改變，表明BRCA1突變穩(wěn)定了細胞核中的p53蛋白，但隨著細胞被p53 shRNA處理，p53的表達水平降低，而HRAS表達只有在HRAS導入的細胞中檢測到（圖2C）。這些數(shù)據(jù)表明永生化細胞中細胞周期的改變可能是這些蛋白質介導的。

2.3 HRAS未能誘導永生化細胞轉化

軟瓊脂實驗顯示，在OSE236、OSE236/p53i、OSE236/p53i/hTERT和OSE236/p53i/hTERT/HRAS細胞中未觀察到細胞集落的形成（圖2D）。隨后，我們將OSE236/p53i/hTERT/HRAS細胞注射到裸鼠身上以測試體內腫瘤生長。皮下接種OSE236/p53i/hTERT/HRAS細胞的6只小鼠在平均3.5個月內均未觀察到腫瘤生長，而對照細胞HEY在接種后3周內腫瘤體積生長可以達到1 000 mm3（圖2E）。提示即使卵巢表面上皮細胞帶有BRCA1 185delAG突變，HRAS也不足以誘導表達p53shRNA和hTERT永生化細胞的轉化。因此，可能需要其他活化的癌基因或滅活的腫瘤抑制基因才能將其完全轉化為腫瘤細胞。

圖 2 細胞周期與體內外腫瘤生長測定Fig. 2 Determination of cell cycles and in vitro and in vivo tumorigenicity

3 討 論

1994年，根據(jù)其在乳腺癌和卵巢癌綜合征中的遺傳功能，位于染色體17q21上的BRCA1被首次鑒定［20］。對其腫瘤抑制功能的機制研究表明，BRCA1參與DNA損傷修復反應并維持基因組完整性［21］。然而，這些功能是通用的，并不能解釋BRCA1突變攜帶者具有特定腫瘤發(fā)生的傾向。關于BRCA1 185delAG的突變很早就有報道［22-24］，但未進行相關人體細胞系的永生化研究。本研究通過敲低p53與hTERT組合建立了攜帶BRCA1 185delAG突變的永生化細胞系。永生化的OSE236/p53i/hTERT和OSE236/p53i/hTERT/HRAS細胞是非致瘤性的，表明OSE236/p53i/hTERT細胞的轉化可能還需要其他腫瘤抑制基因如pRb和PP2A等的失活［25-26］。

永生化細胞和轉化細胞中細胞周期的改變表明，細胞周期檢查點控制分子的異常是細胞永生化必不可少的環(huán)節(jié)。CDK4、細胞周期素B1、D1和E是主要參與OSE236細胞永生化的分子。p53的失活傾向于BRCA1偶聯(lián)的卵巢癌［27-28］。有研究顯示，即使沒有報道的BRCA1突變，通過shRNA敲低p53并結合hTERT的異位表達也可使細胞永生化［17］。

人體組織中發(fā)現(xiàn)的BRCA1 185delAG一般被認為主要與乳腺癌的發(fā)生有關［22，29-30］，但也有明確報道證明其與卵巢癌的發(fā)生密切相關［31-32］。 關于BRCA1 185delAG突變的功能，有研究發(fā)現(xiàn)在卵巢表面上皮細胞中，該BRCA1突變可以抑制AKT依賴、IAP介導的Caspase3失活［33］。還有研究發(fā)現(xiàn)，BRCA1 185delAG突變蛋白可以增強卵巢癌患者對化療藥物的敏感性，同時可能是由于其會促進細胞核內MASPIN高表達而改善患者的預后［34］。但另一項研究發(fā)現(xiàn)，BRCA1 185delAG突變蛋白可能誘導早期卵巢癌上皮細胞表達白細胞介素6［35］。但是目前關于BRCA1 185delAG突變誘導乳腺癌和卵巢癌的詳細機制仍然不清。因此本研究中建立的永生化細胞系將為研究此類遺傳性乳腺癌或卵巢癌的發(fā)生提供一個具有重要價值的細胞模型。據(jù)我們所知，這是卵巢組織中BRCA1基因攜帶185delAG突變上皮細胞永生化的首次報道。盡管用HRAS不能誘導該永生化細胞系的腫瘤生長，但它可能通過進一步引入其他癌基因和（或）失活其他腫瘤抑制基因來研究BRCA1突變家族性卵巢癌發(fā)生的機制。