回瑞華,侯冬巖,李鐵純,刁全平
(鞍山師范學院 化學與生命科學學院,遼寧 鞍山 114007)
蘆丁、槲皮素和桑色素廣泛存在于植物的根、莖、皮、葉、花、果實中,均屬黃酮類化合物.黃酮類化合物具有多種多樣的生物活性,蘆丁、槲皮素和桑色素是具代表性的黃酮類化合物,通常在應用和分析黃酮類化合物時以它們作為對照品.本文采用鄰二氮菲-Cu+-H2O2-碳酸鹽緩沖液流動注射化學發(fā)光法對蘆丁、槲皮素和桑色素清除·OH能力即抗氧化性進行測定.原理如下列反應式[1]:
H2O2+ Cu+→ ·OH +Cu2++ OH-
當加入蘆丁等具有抗氧化性能的化合物后,可清除部分·OH,使發(fā)光強度變?nèi)?,以此測定化合物抗氧化性能力的強弱.
西安瑞邁電子科技有限公司生產(chǎn)的IFFM-D型流動注射化學發(fā)光儀;昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)的KQ-250B型超聲清洗器.
蘆丁、槲皮素、桑色素 (購于中國藥品生物制品檢定所).鄰二氮菲配成濃度為1×10-2mol/ L;氯化亞銅配成濃度為5×10-2mol/ L;過氧化氫需用時配至所需濃度;碳酸鹽緩沖溶液配成pH10.57(試劑均為分析純).
蘆丁、槲皮素、桑色素樣品配制成濃度為0.5 mg/mL的溶液.
啟動IFFM-D型流動注射化學發(fā)光儀[2-5],以鄰二氮菲-Cu+-H2O2-碳酸鹽緩沖液流動注射化學發(fā)光體系為空白,測定抗氧化物抑制后發(fā)光強度,測定其抑制率.
抑制率=(I0-I)/I0×100%,
式中:I0為鄰二氮菲-Cu+-H2O2化學發(fā)光體系的發(fā)光強度;I為抗氧化物抑制后的發(fā)光強度.
抑制率為50%時溶液的濃度,通常用IC50表示.
2.3.1 pH值與抑制率的關系 鄰二氮菲-Cu+-H2O2體系應在堿性條件下產(chǎn)生化學發(fā)光現(xiàn)象,通常pH值不同發(fā)光強度則不同.當鄰二氮菲-Cu+-H2O2體系中H2O2濃度為0.27 mol/L、Cu+濃度為1.0×10-4mol/L、鄰二氮菲濃度為4.0×10-4mol/L、蘆丁濃度為3 μg/mL時,考察緩沖溶液的pH值與抑制率的關系如圖1所示.
2.3.2 H2O2濃度與抑制率的關系 在鄰二氮菲-Cu+-H2O2體系中當pH值為10.57、Cu+離子濃度為1.0×10-4mol/L、鄰二氮菲濃度為4.0×10-4mol/L、蘆丁濃度為3 μg/mL時,H2O2濃度與抑制率的關系如圖2所示.
圖1 pH值與抑制率的關系 圖2 H2O2濃度與抑制率的關系
2.3.3 Cu+濃度與抑制率的關系 在鄰二氮菲-Cu+-H2O2體系中,當pH值為10.57、H2O2濃度為0.27 mol/L、鄰二氮菲濃度為4.0×10-4mol/L、蘆丁濃度為3 μg/mL時,考察Cu+濃度與抑制率的關系如圖3所示.
2.3.4 鄰二氮菲濃度與抑制率的關系 在鄰二氮菲-Cu+-H2O2-碳酸鹽緩沖液體系產(chǎn)生化學發(fā)光時,考察鄰二氮菲濃度與抑制率的關系如圖4所示.
圖3 Cu+濃度與抑制率的關系 圖4 鄰二氮菲濃度與抑制率的關系
2.3.5 溶液流速與抑制率的關系 從發(fā)光體系各溶液的配制、混合至逐漸產(chǎn)生最大發(fā)光強度,隨后發(fā)光強度逐漸衰弱.此過程中流速太慢最大發(fā)光強度信號出現(xiàn)在流通池前,流速太快則會使最大發(fā)光強度信號出現(xiàn)在流通池后,影響測定的準確性.考察溶液流速與抑制率的關系如圖5所示.
2.3.6 樣品測定 用2.3.1-2.3.5各實驗條件與抑制率的關系優(yōu)化結果得到測定樣品抗氧化性的最佳條件,按2.2測定方法測定樣品的抗氧化性,結果如圖6~8所示.
圖5 溶液流速與抑制率的關系 圖6 蘆丁抗氧化性的測定
圖7 槲皮素抗氧化性的測定 圖8 桑色素抗氧化性的測定
由圖6~8可知,隨著蘆丁、槲皮素和桑色素濃度的增加,3體系都具有較強的抗氧化性,抗氧化性隨著各自濃度的增大而逐漸增大.
圖9 蘆丁、槲皮素和桑色素抗氧化性大小比較示意圖
從圖6~8可知,蘆丁、槲皮素和桑色素的IC50(抑制率為50%時溶液的濃度)分別為2.22,2.24,76 μg/mL,如圖9.
用IC50比較蘆丁、槲皮素和桑色素的抗氧化性強弱,由圖9可知:蘆丁的抗氧化性最強,桑色素的抗氧化性最弱.蘆丁、槲皮素和桑色素的抗氧化性強弱是由分子結構決定的,其分子結構如圖10~12所示.
圖10 蘆丁的分子結構示意圖 圖11 槲皮素的分子結構示意圖
由圖10,11可見蘆丁和槲皮素B環(huán)上的兩個羥基都處于鄰位結構,而圖12桑色素B環(huán)上的兩個羥基則處于間位結構.由于該類化合物清除自由基的作用通常是通過自身供氫氧化作用實現(xiàn),羥基處于鄰位可使一個羥基供氫氧化形成羰基,另一羥基更易于形成分子內(nèi)氫鍵,從而使氧化后的化合物穩(wěn)定,并可進一步共振形成鄰苯醌,使自由基更加穩(wěn)定[6-8].由此可知該類化合物結構B環(huán)上的二個羥基位置是具有清除自由基生物活性的關鍵結構.
圖12 桑色素的分子結構示意圖
本文采用鄰二氮菲-Cu+-H2O2-碳酸鹽緩沖液流動注射化學發(fā)光法對蘆丁、槲皮素和桑色素清除·OH能力即抗氧化性進行測定,并對它們的抗氧化性進行比較分析.實驗結果表明,蘆丁、槲皮素和桑色素均具有抗氧化性,蘆丁的抗氧化性最強,槲皮素次之,桑色素的抗氧化性最弱.實驗結果對應用和分析黃酮類化合物或測定抗氧化性工作中選擇對照品具有參考意義.