李玉梅 楊波 劉秦川

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是世界范圍內(nèi)常見的人類惡性腫瘤之一，并且近年來其發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢。據(jù)統(tǒng)計，每年因口腔鱗癌而死亡的人數(shù)超過400 000人，其中80%的死亡人口來自發(fā)展中國家［1］。隨著對口腔鱗癌研究的深入，目前的觀點認為口腔鱗癌是由致癌物引發(fā)的一個多因素、多步驟的復雜生物學過程，其中癌癥相關基因的改變在這一過程中具有重要作用。研究者普遍認為癌癥相關的基因變化來自于遺傳信息的丟失、突變或過表達［2］。microRNAs（miRNA）是一類長度約為22nt的非編碼RNA，通常在轉錄后水平調控靶基因表達［3］。許多miRNA參與了重要的生物學過程，例如細胞分化以及上皮細胞向間充質細胞轉化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）等。目前的研究發(fā)現(xiàn)在許多腫瘤組織中，均發(fā)生了miRNA的含量改變［4］。但目前對于口腔鱗狀細胞癌與miRNA表達改變的報道較少，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些與口腔鱗癌的發(fā)生和發(fā)展存在一定聯(lián)系的miRNA，其中包括miR-34b，miR-100，miR-125b miR-137，miR-193a和miR-203等。與正常口腔黏膜組織相比，這些miRNA的表達含量在口腔鱗癌中發(fā)生特異性的改變［5］。此外，多項研究證明miR-126的含量在結腸癌、胃癌以及惡性血液腫瘤中發(fā)生了顯著改變［6-8］。但是miR-126是否參與了口腔鱗癌細胞的生物學功能過程，目前尚未有文獻報道。本研究檢測miR-126在口腔鱗癌以及正常口腔黏膜組織中的表達水平差異，并改變口腔鱗癌細胞中miR-126的表達水平來觀察其在增值、遷移方面的變化，進而探究miR-126在口腔鱗癌中可能的作用并為臨床診療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

自2010-08～2017-06共收集于漢川市人民醫(yī)院口腔科確診的18例口腔鱗癌患者的鱗癌標本及周邊非癌變口腔黏膜組織，所有收集標本均經(jīng)病理檢查明確診斷及腫瘤細胞惡性程度判定。8例正?？谇火つ吮緛碜哉３赡曛驹刚?。詳細記錄納入標本提供者的年齡、性別、吸煙史等資料。本研究經(jīng)過倫理委員會批準，所有標本提供者均簽署知情同意書?？谇击[狀細胞癌細胞系（SCC-4，SCC-9和SCC-15）購于上海中科院細胞庫。

1.2 實驗試劑

DMEM/F12完全培養(yǎng)基、Trizol提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、Lipofectatmine 3000、PIK3R1抗體（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；MTT細胞活力檢測試劑（Sigma公司，美國）；Matrigel基質膠（BD公司，美國）；miR-126 agomir、miR-126 antagomir及陰性對照（negative control）（上海吉瑪制藥技術公司，美國）；Western bolt相關試劑、RIPA蛋白裂解液（上海碧云天生物技術公司）；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（Promega公司，美國）。

1.3 qRT-PCR

使用Trizol法提取標本總RNA，并用Nano-Drop2000紫外分光光度計檢測RNA 濃度和純度（A260：A280）。將miRNA 逆轉錄成cDNA，合成的cDNA產(chǎn)物直接用于PCR或保存于-20℃待用。采用SYBR GreenⅠ法進行miR-126的實時熒光定量檢測。反應體系如下：miR-127逆轉錄產(chǎn)物2μl，SYBR Green Mix 9μl，上下游引物各1μl，加入DEPC水將反應總體系配至20μl。PCR反應程序如下：預變性：94℃5 min，變性：94℃30 s，退火：58℃30 s，延伸：72℃30 s，設置30個反應循環(huán)。采用2-ΔΔCt法分析實驗結果。U6為miR-126內(nèi)參。miR-126引物根據(jù)基因組數(shù)據(jù)庫設計，由上海吉瑪公司合成。

1.4 細胞轉染

口腔鱗癌細胞系SCC-4細胞置于恒溫CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待匯合度達80%左右加入Lipofectamine試劑進行轉染。將口腔鱗癌細胞分為3組，分別加入miR-126 agomir、miR-126 antagomir以及negative control。后將細胞置于5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培育1～3 d以供檢測。

1.5 Western blot檢測PIK3R1蛋白表達水平

洗滌并收集SCC-4細胞，使用RIPA裂解液獲得蛋白，BCA法測定蛋白含量，后加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液煮沸。配制10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠，將蛋白樣品以20μl/孔上樣，設定70 V恒壓電泳，蛋白質轉印60 min，封閉1 h。后按照抗體說明書稀釋一抗，加入PVDF膜4℃孵育過夜。次日TBST洗滌后加入二抗，室溫孵育1 h后顯色，獲得圖像使用Image J軟件分析。

1.6 MTT法檢測細胞增殖能力

分別將轉染miR-126 agomir、miR-126 antagomir以及negative control的SCC-4細胞消化為懸液后接種至96孔板，每種細胞每孔接種量為2×103個，置于37℃5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，在每孔細胞中加入20μl MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，將細胞培養(yǎng)液棄去，每孔加入DMSO 200μl，搖床混勻約10 min，用酶標儀測定A570nm光吸收值繪制細胞生長曲線。

1.7 Transwell遷移實驗

收集不同轉染組的SCC-4細胞，加入DMEM基礎培養(yǎng)基，使用計數(shù)板將細胞懸液吸出滴入計數(shù)板，統(tǒng)計計數(shù)板中四大格細胞數(shù)，調整細胞濃度，將1×103個細胞懸液加入transwell小室，并于24孔板下室加入500μl DMEM完全培養(yǎng)基；將24孔板置于恒溫培養(yǎng)箱中48 h，后取出小室移除培養(yǎng)基，將小室底膜進行甲苯胺藍染色。

1.8 雙熒光素酶報告基因檢測

根據(jù)Promega雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書，將包含有與相應miRNA-126互補結合的靶基因PIK3R1 3'-UTR序列片段和突變的3'-UTR序列片段克隆到pGL3-Luciferase基因下游的多克隆位點中。正常培養(yǎng)的Hela 493T細胞，以4×105個/ml接種于6孔培養(yǎng)板，每孔體積1 ml。轉染包含PIK3R1 3'-UTR或突變的PIK3R1 3'-UTR的熒光素酶質粒，以及miRNA-126 agomir、miRNA-126 antagomir或negative control。轉染48 h后收集293T細胞，進行雙熒光素酶活性檢測。

1.9 統(tǒng)計學分析

采用SPSS17.0進行統(tǒng)計學分析，計量資料用±s表示，2組間比較采用t檢驗，多組間分析用單因素方差分析，當P＜0.05時表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 miR-126在口腔鱗癌組織和正常組織中的表達

采用qRT-PCR檢測口腔鱗癌組織及正?？谇火つそM織中miR-126的表達水平，結果顯示，miR-126在口腔鱗癌組織中表達降低，含量為正?？谇火つそM織的0.64倍，具有顯著統(tǒng)計學差異（P＜0.05）（圖1）。

2.2 不同鱗癌細胞系中miR-126表達水平

采用qRT-PCR檢測正?？谇火つど掀ぜ毎?、SCC-4，SCC-9和SCC-15中miR-126表達水平，結果顯示，3種口腔鱗癌細胞中miR-126表達水平均低于正?？谇火つど掀ぜ毎?，其中SCC-9中表達水平最低，具有顯著統(tǒng)計學差異（P＜0.05；P＜0.01）。因此使用SCC-9進行后續(xù)實驗（圖2）。

2.3 細胞轉染效率檢測

在口腔鱗癌細胞中分別轉染miR-126 agomir、miR-126 antagomir以及negative control，采用qRT-PCR檢測轉染后miR-126表達水平，結果顯示miR-126 agomir可以顯著上調細胞中miR-126的表達水平，反之，加入miR-126 antagomir后其表達水平受到抑制，表達差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖3）。

圖1 口腔黏膜正常組織和鱗癌組織中miR-126表達水平Fig 1 miR-126 expression in normal and oral mucosa and OSCC

圖2 不同口腔鱗癌細胞系中miR-126表達水平Fig 2 miR-126 expression levels in different OSCCcell lines

圖3 不同轉染條件下miR-126的表達水平Fig 3 miR-126 expression levels under different transfection conditions

2.4 miR-126對口腔鱗癌細胞增殖能力的影響

MTT法檢測不同處理組鱗癌細胞的增殖能力，顯示上調miR-126表達含量后，細胞增殖能力受到明顯抑制，反之，下調miR-126的表達后，細胞增殖能力明顯提高，結果具有顯著統(tǒng)計學差異（P＜0.05）（圖4）。

2.5 miR-126對口腔鱗癌細胞遷移能力的影響

使用transwell小室檢測不同處理組口腔鱗癌細胞的遷移能力，結果發(fā)現(xiàn)相較于對照組，上調miR-126后，細胞遷移能力受到抑制，反之，下調miR-126的表達后，細胞的增殖能力得到提高，結果具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）（圖5）。

圖4 不同轉染條件下對鱗癌細胞增殖能力的影響Fig 4 The effect of different transfection conditions on the proliferation of OSCCcells

圖5 不同轉染條件下對鱗癌細胞遷移能力的影響 （甲苯胺藍染色，×200）Fig 5 The effect of different transfection conditions on the migration ability of OSCC cells （Toluidine staining，×200）

2.6 雙熒光素酶報告基因檢測miR-126靶基因

為檢測miR-126可能的靶基因，搜索生物信息學網(wǎng)站miRanda和Targetscan，發(fā)現(xiàn)PIK3R1的3'UTR區(qū)存在miR-126的結合位點，因此推測miR-126可能調節(jié)PIK3R1的表達。同時，采用Western blot檢測不同轉染組中PIK3R1的表達水平，結果發(fā)現(xiàn)下調miR-126后PIK3R1的表達水平上升，反之，下調miR-126后PIK3R1的表達水平上升，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖6）。為進一步明確miR-126與PIK3R1存在直接結合，構建含有PIK3R1 3'UTR結合位點的熒光素酶報告基因表達載體。結果顯示，在含有PIK3R1 3'UTR序列的細胞中，加入miR-126后，較之對照組其熒光素酶活性明顯降低（P＜0.01），而在PIK3R1 3'UTR突變組中則無明顯改變（圖7）。

圖6 不同轉染條件下PIK3R1蛋白表達水平Fig 6 PIK3R1 protein expression under different transfection conditions

圖7 雙熒光素酶報告基因實驗Fig 7 Dual luciferase reporter experiment

3 討 論

MicroRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子。第一個miRNA是在20世紀90年代初發(fā)現(xiàn)的。然而，直到21世紀初，miRNA才被認為是具有獨特調節(jié)功能的一類物質。其自身通常不參與編碼合成mRNA，而是在轉錄后水平參與靶基因調控過程，其作用遍及生命體的發(fā)生、生長、發(fā)育、分化和死亡的各個過程。如楊倩娟等［9］發(fā)現(xiàn)miR-20可參與人炎癥牙周膜干細胞成骨分化過程。其他研究也發(fā)現(xiàn)細胞在發(fā)生病理過程中其miRNAs表達也發(fā)生不同變化［10］。2009年的一項研究探討了miR-205的表達水平對乳腺癌轉移的影響［11］。一項針對小細胞肺癌樣本的研究發(fā)現(xiàn)，miR-324a的水平可作為預測患者預后生存的指標［12］。近年來的研究發(fā)現(xiàn)miRNAs與口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展以及預后也有著緊密的關聯(lián)。Shin等［13］證實miR-181a在口腔鱗癌細胞中的表達量降低，而提高miR-181a的表達含量可以抑制其靶基因K-ras的表達從而抑制了鱗癌細胞的增殖能力。近年的一項納入了29例口腔鱗癌患者與7例健康對照者進行分析，通過檢測鱗癌細胞和正?？谇火つぜ毎幕蜃V發(fā)現(xiàn)在口腔鱗癌腫瘤組織中有12個microRNAs上調及11 microRNA下調［14］。這些異常表達的microRNA可能與細胞增殖分化、凋亡、血管形成、腫瘤浸潤及轉移等多種功能相關。

MiR-126最初被發(fā)現(xiàn)在內(nèi)皮細胞中表達，在血管新生中發(fā)揮著重要的作用［15］。最近的多項研究發(fā)現(xiàn)miR-126與腫瘤細胞的增殖與侵襲能力有關。如miR-126可通過RhoA/ROCK信號通路抑制結腸癌細胞的增殖和侵襲［16］。MiR-126還可靶向作用于PIK3R2介導的PI3K/Akt通過調節(jié)膽囊癌細胞的生物學功能［17］。然而，對于miR-126與口腔鱗癌的關系研究較少。Yang等［18］發(fā)現(xiàn)miR-126可以靶向于EGFL7來抑制口腔鱗癌細胞的細胞周期，此外，過表達miR-126可以抑制血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和成纖維細胞生長因子（bFGF）的表達。本次研究通過生物信息學軟件預測miR-126可能的作用靶基因，并采用雙熒光素酶報告基因實驗等方法進一步驗證了miR-126與靶基因PIK3R1存在相關關系，證明了miR-126對于口腔鱗癌細胞生物學功能調節(jié)的可能作用機制。與此同時，采用miR-126的模擬物以及抑制物進行細胞轉染，一系列的體外實驗也均證實在口腔鱗癌細胞中改變miR-126的表達對于其生物學功能有著顯著的調節(jié)作用。

綜上所述，該研究發(fā)現(xiàn)口腔鱗癌細胞中，miR-126的表達水平顯著降低，同時改變miR-126的表達水平可以調節(jié)口腔鱗癌細胞的增殖和遷移能力，此外，miR-126可作用于PIK3R1發(fā)揮其調節(jié)作用；因此miR-126可能作為一個潛在的治療靶點，對于口腔鱗癌的治療提供新的思路。