周 濤 吳曉營 - 羅海波 - 滿文曾 - 王 芮 萬辰玥 -

(南京師范大學食品與制藥工程學院，江蘇 南京 210097)

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)又名小龍蝦、紅螯蝦，其肉質(zhì)鮮美、風味獨特、營養(yǎng)價值高，是中國目前市場上最暢銷的淡水蝦類[1]?，F(xiàn)已形成了集“苗種繁育、健康養(yǎng)殖、加工出口、餐飲物流、節(jié)慶文化”于一體的產(chǎn)業(yè)鏈條[2]。目前，中國淡水小龍蝦主要以生鮮銷售、冷凍粗加工和即食產(chǎn)品為主，即食小龍蝦產(chǎn)品改變了季節(jié)性對其銷售和消費的限制，但也存在貨架期短等問題。水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)主要歸結(jié)于細菌的侵染，隨貯藏時間的延長，只有少數(shù)特定種類的微生物迅速增長，并逐漸占據(jù)主導地位，生長代謝產(chǎn)生一些不良物質(zhì)，導致產(chǎn)品腐敗變質(zhì)，這類細菌就是特定腐敗菌(specific spoilage organisms，SSO)[3-5]，如果能對產(chǎn)品中特定腐敗菌進行控制即可有效延長貨架期。所以有必要了解產(chǎn)品在貯藏過程中菌群結(jié)構(gòu)與變化規(guī)律，對引起產(chǎn)品變質(zhì)的特定腐敗菌進行研究，從而達到靶向抑制產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的目的。

近年來，隨著分子生物學的發(fā)展，高通量測序技術(shù)已被廣泛應用于分析微生物菌群多樣性的變化。高通量測序是一種非培養(yǎng)分析法，無需對菌株進行培養(yǎng)，可以直接通過提取、分析樣品的DNA來對微生物多樣性進行分析[6]，目前已成功應用在鯧魚[7]、蟹糊[8]、帶魚[9]、蝦夷扇貝柱[10]、南極磷蝦[11]、牡蠣[12]等水產(chǎn)品中微生物菌群多樣性的分析。江楊陽等[13]同時利用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和高通量測序技術(shù)對冷藏小龍蝦進行優(yōu)勢腐敗菌的分析，但通過該技術(shù)對小龍蝦即食產(chǎn)品菌群多樣性進行分析的尚未見報道。試驗擬將即食小龍蝦產(chǎn)品置于兩種常用貯藏溫度下，旨在了解產(chǎn)品在不同貯藏溫度下品質(zhì)及菌群多樣性變化，為企業(yè)在殺菌參數(shù)確定、車間衛(wèi)生管理、靶向抑制產(chǎn)品腐敗變質(zhì)及研發(fā)防腐保鮮技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小龍蝦：購于江蘇盱眙水產(chǎn)市場；

平板計數(shù)瓊脂(PCA)：海博生物技術(shù)有限公司；

細菌基因組DNA提取試劑盒：生工生物工程(上海)股份有限公司；

硼酸、MgO：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

高純度耐熱DNA聚合酶：南京諾唯贊生物科技有限公司；

DNA產(chǎn)物純化試劑盒：北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

自動凱氏定氮儀：K9840型，海能儀器有限公司；

PCR儀：T100TM Thermal Cyeler型，美國BIO-RAD公司；

電泳槽：DYCZ-21型，北京市六一儀器廠；

凝膠成像系統(tǒng)：EC3 500型，美國UVP公司；

漩渦混合器：GL-88B型，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；

移液器：Research型，0.5～10.0 μL，德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的加工工藝

鮮活小龍蝦→鹽水吐污6 h→機械清洗、挑選鮮活小龍蝦→油炸→調(diào)味煮制→冷卻→真空包裝→滅菌(100 ℃，20 min)→即食產(chǎn)品

1.3.2 樣品的處理 樣品分別貯藏于25，4 ℃條件下，分別每隔2，5 d取蝦肉樣品(去頭、去殼、去蝦線)測定其理化指標。

1.3.3 微生物菌落總數(shù)的測定 按GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》執(zhí)行。

1.3.4 揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)的測定 按GB/T 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》的自動凱氏定氮儀法執(zhí)行。

1.3.5 DNA的提取 分別選取兩個貯藏溫度下中、末期的小龍蝦蝦肉(去頭、去殼、去蝦線)，利用液氮研磨的方法處理后，提取樣品總DNA。

1.3.6 PCR擴增 以提取的基因組DNA作為模板，參照江艷華等[10]的擴增條件對16S rDNA序列的V3-V4可變區(qū)域進行擴增。引物序列如表1所示。擴增結(jié)束后，檢測DNA分子質(zhì)量，質(zhì)量滿足要求的送至生工生物工程(上海)股份有限公司通過高通量測序技術(shù)做進一步分析。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理 Miseq測序系統(tǒng)測序序列中含有標簽序列，以及測序時加入的引物和接頭序列。首先將成對的測序序列拼接成一條序列，隨后根據(jù)標簽序列區(qū)分樣品得到各樣本數(shù)據(jù)，對各樣本序列進行質(zhì)量控制，過濾掉質(zhì)量不符合要求的序列[14]。將多條序列進行聚類分析，一般將相似性>0.97的序列進行歸并，生成操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)。根據(jù)聚類分析結(jié)果，計算得到ACE、Chao1、Shannon、Simpson指數(shù)，進行Alpha多樣性分析，其中ACE、Chao1指數(shù)是對菌群豐度進行評估，Shannon、Simpson指數(shù)是對菌群多樣性進行評估[15]。基于分類學分析對比結(jié)果，來討論小龍蝦即食產(chǎn)品在不同貯藏溫度、時間條件下菌群結(jié)構(gòu)及變化規(guī)律。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析 每組試驗進行3次平行。應用Excel 2010軟件對數(shù)據(jù)進行整理、繪圖；應用Prinseq 0.20.4、Pear 0.9.6、Cutadapt 1.2.1軟件對各樣本數(shù)據(jù)進行質(zhì)控過濾，得到樣本有效數(shù)據(jù)；應用Usearch 5.2.236、Mothur 1.30.1、R 3.2等軟件對樣本進行OTU聚類、Alpha多樣性和菌群多樣性分析。

表1 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 小龍蝦即食產(chǎn)品在不同貯藏溫度下的品質(zhì)變化

2.1.1 菌落總數(shù) 不同貯藏條件下小龍蝦即食產(chǎn)品菌落總數(shù)變化見圖1、2。Al-Dagal等[16]研究表明：蝦類產(chǎn)品分兩個鮮度，其菌落總數(shù)<5.00 lg(CFU/g)為一級鮮度，在5.00～5.70 lg(CFU/g)的為二級鮮度，當>5.70 lg(CFU/g)時已經(jīng)腐敗不能再食用，即到達貨架期末期。

由圖1、2可知：兩個貯藏溫度下，菌落總數(shù)均呈增長趨勢，25 ℃條件下增長速度較快，幾乎呈直線增長趨勢，第6天菌落總數(shù)指標已超過二級鮮度，到達理論腐敗期，第8天時菌落總數(shù)已遠遠超過5.70 lg(CFU/g)，酸臭味強烈，達到可接受的極限；4 ℃貯藏條件下，前期菌落總數(shù)增加緩慢，第15天開始增長速度加快，第35天時已超過蝦類產(chǎn)品的二級鮮度指標，達到理論腐敗值。

圖1 25 ℃貯藏溫度下小龍蝦即食產(chǎn)品菌落總數(shù)和揮發(fā)性鹽基氮的變化

Figure 1 The change of total numbers of colony and volatile basic nitrogen on conditioning crayfish during 25 ℃storage

圖2 4 ℃貯藏溫度下小龍蝦即食產(chǎn)品菌落總數(shù)和揮發(fā)性鹽基氮的變化

Figure 2 The change of total numbers of colony and volatile basic nitrogen on conditioning crayfish during 4 ℃storage

初步推斷25 ℃貯藏條件下貯藏期為6 d，4 ℃貯藏條件下貯藏期為35 d。

2.1.2 TVB-N值 小龍蝦蛋白含量較高，死后其蛋白質(zhì)等含氮物質(zhì)在酶和微生物的作用下會分解成揮發(fā)性氨以及低級胺類等化合物，即揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)[17]。根據(jù)GB 10136—2015《動物性水產(chǎn)制品》規(guī)定，動物性食品中TVB-N值≤30.00 mg/100 g為合格品。即食小龍蝦貯藏期間TVB-N變化如圖2所示。

由圖1可知， 25 ℃貯藏溫度下，TVB-N含量幾乎呈直線增長，第6天時TVB-N值已達到28.94 mg/100 g，臨近GB 10136—2015規(guī)定的限值，第8天已遠遠超過限值。結(jié)合第6天的菌落總數(shù)為5.74 lg(CFU/g)，已超過蝦類產(chǎn)品的二級鮮度指標?？煽闯鯰VB-N值作為鮮度判定要比菌落總數(shù)值滯后，與前人對哈氏仿對蝦[18]和冷藏小龍蝦[13]的研究結(jié)果一致，故綜合兩指標認為25 ℃貯藏溫度下貨架期為6 d。中期樣品取第3天的龍蝦肉(記為C3)，末期樣品取第6天的龍蝦肉(記為C6)。

由圖2可知，4 ℃貯藏溫度下，前期增長緩慢，后期幾乎呈直線增長，與后期微生物數(shù)量大幅度增加有較大關(guān)聯(lián)，微生物分解蛋白質(zhì)從而產(chǎn)生揮發(fā)性氨以及低級胺類等化合物，使得TVB-N值增加。在第30天時TVB-N值接近GB 10136—2015規(guī)定的限值，第35天時稍超過限值，結(jié)合菌落總數(shù)變化情況，將第35天視為貯藏末期。中期樣品取第15天的龍蝦肉(記為B15)，末期樣品取第35天的龍蝦肉(記為B35)。

2.2 小龍蝦即食產(chǎn)品在不同貯藏溫度下的菌群變化

2.2.1 基因組DNA提取及PCR擴增 分別取不同貯藏溫度下中期和末期的龍蝦肉4份，利用液氮研磨的方法提取其總DNA，經(jīng)PCR擴增V3-V4可變區(qū)后瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量。如圖3所示各樣品目的片段條帶清晰，滿足后續(xù)測序試驗要求。

M. DNA分子量標準 1. B15 2. B35 3. C3 4. C6

2.2.2 測序序列分析 為了保證信息分析質(zhì)量，必須對雜合的DNA片段(即嵌合體)進行剔除，去除嵌合體與靶區(qū)域外序列統(tǒng)計表見表2。從表2可看出，經(jīng)質(zhì)控和優(yōu)化后每個組的有效序列數(shù)均在30 000以上，有效序列的百分比達89.00%以上，C6樣品達到99.77%。覆蓋率作為樣本完整性指標，表示樣品中總物種的百分比[19]。4個樣品的覆蓋率均在0.99以上，表明所得有效序列可達到后續(xù)分析的要求。通過比對4個樣品的OTU數(shù)量可知，隨貯藏時間的延長，OTU數(shù)量下降，物種豐度下降。

表2 各組樣品有效序列與OTU數(shù)量統(tǒng)計

2.2.3 Alpha多樣性分析 使用Ace、Chao1、Shannon及Simpson指標對微生物菌群的豐富度及其個體分配均勻性進行評估[20]。由表3可知，兩種貯藏溫度下，中期階段25 ℃ 條件下菌群多樣性更高，Ace、Chao1、Shannon 3個指標變化較大，但Simpson并無變化，均為0.05，可能是Simpson數(shù)值主要綜合體現(xiàn)物種的豐富度和均勻度，在考慮種類數(shù)目變化的同時，還考慮了種類之間的配比變化[13]。隨貯藏時間延長，物種豐度和多樣性均下降，尤其常溫條件下菌群豐度指標急劇下降，證實了貯藏后期優(yōu)勢腐敗菌屬的大量存在，產(chǎn)生不良代謝物影響其他菌種生長，從而使得物種多樣性降低。

表3 小龍蝦不同貯藏時期菌群的Alpha多樣性比較

根據(jù)以上數(shù)據(jù)可得到稀釋曲線(圖4)。稀釋曲線可用來評估樣品中物種的豐富度，也可通過觀察直線是否趨于平緩來判斷樣本的測序數(shù)據(jù)量是否合理。如圖4所示，在橫坐標剛開始，曲線便趨于平緩，說明測序數(shù)量已足夠。

圖4 Shannon稀釋曲線分析

2.2.4 菌群多樣性分析 采用該RDP classifier方法對樣品獲得的OTU進行屬水平上的物種分類。4個樣品中主要屬水平下分類見表4。由表4可知，不同貯藏溫度、時期，菌群結(jié)構(gòu)有較大差異。貯藏中期除去未分類菌群，兩種貯藏溫度下豐度最大的均為棍狀厭氧菌屬(4 ℃條件下：18.239%；25 ℃條件下：3.595%)；貯藏末期，4 ℃貯藏條件下優(yōu)勢菌群為海洋桿菌屬(Oceanobacillus，81.522%)和希瓦氏菌屬(Shewanella，3.625%)，25 ℃貯藏條件下優(yōu)勢菌群為哈撒韋氏菌屬(Hathewaya，78.700%)、芽孢桿菌屬(Bacillus，12.380%)和狹義梭菌屬(Clostridiumsensustricto，8.707%)。不同的貯藏條件下微生物耐受力不同，故后期菌群結(jié)構(gòu)存在差異。

表4 不同貯藏溫度及時期樣品菌群在屬水平上的分布?

? 菌屬1～3為目前無中文名或統(tǒng)一名稱的菌屬。

棍狀厭氧菌屬(Anaerorhabdus)是一種腸桿菌，蔡麗萍等[20]在野生鋸緣青蟹腸道中也檢出了該菌屬為優(yōu)勢菌群。可能是小龍蝦自身所攜帶的菌體，加工處理過程中未完全滅活或被二次污染使之成為貯藏中期主要菌屬。但隨貯藏時間的延長，該菌屬豐度逐漸降低，尤其在25 ℃ 條件下豐度降為0，可能是后期環(huán)境不適宜其生長或優(yōu)勢腐敗菌的出現(xiàn)抑制其生長。

哈撒韋氏菌屬(Hathewaya)和海洋桿菌屬(Oceanobacillus)在腐敗末期占據(jù)主要地位。哈撒韋氏菌屬之前被定義為梭狀芽孢桿菌屬類群二[21]，革蘭氏陽性菌，優(yōu)先分解蛋白，最適生長溫度30 ℃左右，最適pH值6.0～8.5[22]。25 ℃貯藏條件下溫度、pH正適合哈撒韋氏菌屬的生長，且龍蝦是高蛋白產(chǎn)品，后期蛋白分解，使得豐度增長到78.700%，成為25 ℃貯藏末期主要的菌屬。海洋桿菌屬是與芽孢桿菌屬相關(guān)的新菌屬[23]，呈革蘭氏陽性，是一種耐鹽親堿菌。Lu等[24-25]曾在一種深海生物中分離出海洋桿菌屬，Yumoto等[26]也曾在淡水湖里虹鱒的魚皮中分離出海洋桿菌屬。海洋桿菌屬在冷藏末期相對豐度達81.522%，表明其可能在產(chǎn)品腐敗變質(zhì)過程中起到重要作用，但中國有關(guān)此菌屬的研究較少，后續(xù)研究應重點關(guān)注。

希瓦氏菌屬(Shewanella)和芽孢桿菌屬(Bacillus)是常見的水產(chǎn)品中腐敗菌屬。希瓦氏菌屬代謝能力極強，能適應多種鹽濃度、溫度及氣體環(huán)境，是一種嗜冷性菌屬，故在冷藏期間豐度增加，成為優(yōu)勢菌屬之一。其模式菌種為腐敗希瓦氏菌，作為冷藏海水魚中主要腐敗菌被人們熟知，但隨著研究的深入，在淡水養(yǎng)殖動物中也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)[27]。芽孢桿菌屬大多來源于土壤和空氣中，可能是小龍蝦在淤泥中生長，自身感染或在后期加工過程中二次污染所殘留的耐熱芽孢桿菌，常規(guī)殺菌方法難以將其殺滅，在適宜條件下再次生長。此外，還有一些菌屬雖然相對豐度較小，但可能在產(chǎn)品腐敗變質(zhì)過程中也起重要作用。

已有研究[28]表明，水產(chǎn)品中主要的優(yōu)勢腐敗菌有弧菌屬(Vibrionaceae)、腸桿菌屬(Enterobacteriaceae)、假單孢菌屬(Pseudomonas)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、乳酸菌(Lacticacidbacteria)、芽孢桿菌屬(Bacillus)及梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)等，不同水產(chǎn)品的腐敗菌種類也大不相同。小龍蝦的品種、生長環(huán)境和后期加工均會使得優(yōu)勢腐敗菌有所不同[5]，故在研發(fā)產(chǎn)品保鮮劑時，應針對具體的產(chǎn)品、加工和貯藏條件，綜合考慮各種影響因素。此外，低溫殺菌雖然對產(chǎn)品肉質(zhì)影響較小，但具有一定局限性，難以殺死產(chǎn)芽孢的細菌。為了不影響肉制品口感、風味可采用其他溫和且安全的殺菌方式，例如輻照殺菌技術(shù)或其他的物理殺菌方法，避免對含芽孢的菌屬滅菌不徹底，使得后期再次生長?？傊?，最好采取物理、化學和生物方法相結(jié)合的方式有針對性地進行防腐保鮮技術(shù)的研究，達到延長產(chǎn)品貨架期、保障產(chǎn)品衛(wèi)生安全的目的。

3 結(jié)論

試驗對不同貯藏溫度下即食小龍蝦品質(zhì)及菌群結(jié)構(gòu)進行了研究。結(jié)果表明：產(chǎn)品在25，4 ℃條件下的貨架期分別為6，35 d；隨著貯藏時間的延長，菌群多樣性降低，并出現(xiàn)了優(yōu)勢腐敗菌，但兩種貯藏溫度下優(yōu)勢腐敗菌各不同；低溫殺菌存在一定局限性，食用前最好經(jīng)過微波加熱。研究通過高通量測序技術(shù)分析了貯藏中期和末期菌群在屬水平上的變化，但無法確定到具體的腐敗菌種，下一步可用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法對末期樣品中腐敗菌進行分離純化，深層次地研究其生長條件和腐敗特性，從而有針對性地抑制產(chǎn)品的腐敗變質(zhì)。另外在研究即食小龍蝦加工和保鮮的過程中，需綜合考慮各種影響因素，進一步探索安全且有效的殺菌方式和保鮮技術(shù)，保證即食小龍蝦的食用安全性，擴大消費市場。