鄭盼盼 姚 楠 高小博 駱海燕 邵馨妍 陸彩玲*

1.國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所(北京,100081);2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院

卵泡發(fā)育的機(jī)制復(fù)雜，涉及多種基因、激素、生長因子的相互作用[1]。卵泡刺激素(FSH)刺激顆粒細(xì)胞分化，是促卵泡發(fā)育成排卵前卵泡的主要信號[2]。顆粒細(xì)胞在FSH和黃體生成素(LH)的刺激下產(chǎn)生甾體激素雌激素和孕酮(P)，在月經(jīng)周期以及卵泡發(fā)育、排卵和妊娠等起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[3-4]。近10年來，對miRNA的研究揭示了miRNA在顆粒細(xì)胞增殖和甾體激素合成中扮演重要角色。miR-132是一個高度保守的miRNA。 Fiedler 等[5]發(fā)現(xiàn)miR-132是排卵前后小鼠顆粒細(xì)胞的差異表達(dá)基因之一，并受cAMP轉(zhuǎn)錄調(diào)控和誘導(dǎo)。筆者實(shí)驗(yàn)室前期以FSH刺激前后孕酮分泌顯著增加的大鼠原代培養(yǎng)顆粒細(xì)胞為模型進(jìn)行miRNA芯片分析，發(fā)現(xiàn)31個表達(dá)差異的miRNA，其中miR-132是篩選到的受FSH調(diào)控變化幅度差異最顯著的基因之一[6]。miR-132在FSH介導(dǎo)的卵巢顆粒細(xì)胞合成孕酮中的作用未見報(bào)道。本研究以miR-132為研究對象，分析FSH對顆粒細(xì)胞miR-132表達(dá)的影響，探討miR-132在孕酮合成中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

原代顆粒細(xì)胞，取自21d齡SD大鼠雙側(cè)卵巢組織。用含10%胎牛血清(FBS，美國Hyclone)的DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Hyclone)在37℃、5% CO2的飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.2 原代顆粒細(xì)胞培養(yǎng)

健康21d齡的雌性SD大鼠購自于維通利華公司，每只大鼠腹腔注射20U孕馬血清(PMSG，上海海德創(chuàng)業(yè)生物公司)，并給予飲水、飼料和自動控制溫度光照飼養(yǎng)。48h后頸椎脫臼處死，無菌條件下剖腹取出卵巢，用注射器針頭刺破卵泡釋放顆粒細(xì)胞。將顆粒細(xì)胞重懸并以合適的密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，以備后續(xù)處理。

1.3 腺病毒感染及FSH處理

重組腺病毒Ad-miR對照和Ad-miR132購自上海吉凱科技有限公司。每個35mm培養(yǎng)皿以3×1011粒子/ml的腺病毒感染顆粒細(xì)胞，培養(yǎng)5h后換成無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，24 h后用50ng/ml FSH暴露處理原代顆粒細(xì)胞24 h。

1.4 顆粒細(xì)胞RNA提取及實(shí)時定量RT-PCR檢測

取經(jīng)培養(yǎng)及不同處理的原代顆粒細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，加入1×磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，加入RNA提取試劑Trizol(美國Invitrogen)，充分吹打至細(xì)胞完全溶解后，利用苯酚/氯仿抽提法提取RNA。取1μg RNA，利用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo)和梯度PCR儀(英國Techne)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，采用實(shí)時定量PCR儀(美國ABI Prism 7500)檢測細(xì)胞miR-132的水平，以U6snRNA的表達(dá)水平為內(nèi)參，實(shí)時定量RT-PCR引物U6snRNA由華大基因公司合成。

1.5 放射免疫法測定P

原代顆粒細(xì)胞用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)過不同處理后收集細(xì)胞上清，儲存于-20℃，采用放射免疫法測定P水平。

1.6 Western Blot檢測Foxo3a的表達(dá)

用50ng/ml的FSH分別處理原代顆粒細(xì)胞0，6，12，24和48h后，收集原代顆粒細(xì)胞，加入20μl 高效細(xì)胞裂解液(RIPA，北京索萊寶科技有限公司)冰上漩渦震蕩裂解30min，12 000rpm 4℃離心15min，收集上清。利用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(美國Thermo)進(jìn)行蛋白濃度定量，全自動酶標(biāo)儀(德國BioTek)進(jìn)行數(shù)據(jù)檢測。12% SDS-PAGE分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶封閉后，Anti-Foxo3a(兔多克隆抗體，美國CST，1:1000)和β-actin抗體(小鼠單克隆抗體，美國Sigma，1:2000)分別于4℃孵育過夜。TBST漂洗，隨后用HRP標(biāo)記的二抗1:2000[辣根過氧化物酶(HRP)-山羊抗兔IgG二抗和山羊抗小鼠IgG二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司]室溫孵育1 h，TBST漂洗，ECL化學(xué)發(fā)光液(美國Merck Millipore)顯影，其中β-actin為內(nèi)參。用Image J軟件定量分析蛋白條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FSH對原代顆粒細(xì)胞miR-132表達(dá)的影響

原代顆粒細(xì)胞經(jīng)50ng/ml FSH暴露后miR-132的表達(dá)量升高，在48h時表達(dá)量最高(圖1)。

圖1 FSH暴露不同時間miR-132相對濃度的表達(dá)

2.2 重組腺病毒過表達(dá)miR-132的鑒定

感染Ad-miR132組的細(xì)胞miR-132表達(dá)水平高于腺病毒Ad-miR對照組(P<0.001)(圖2)。

2.3 miR-132過表達(dá)對顆粒細(xì)胞孕酮合成的影響

FSH暴露處理24h后,感染Ad-miR132組P水平高于空白對照組和Ad-miR對照組(P<0.001)(圖3)。

***與重組腺病毒Ad-miR對照組比較P<0.001圖2 重組腺病毒感染后miR-132相對濃度的表達(dá)

***與未經(jīng)FSH處理組比較P<0.001###與重組腺病毒Ad-miR對照組比較P<0.001圖3 miR-132過表達(dá)后P合成水平

2.4 FSH對顆粒細(xì)胞Foxo3a表達(dá)的影響

在FSH處理后的不同時間點(diǎn)，F(xiàn)oxo3a表達(dá)呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(圖4)，提示miR-132可能負(fù)調(diào)控了Foxo3a的表達(dá)。

與未經(jīng)FSH處理組比較 *P<0.05 **P<0.01 ***P <0.001A：蛋白免疫印跡 B：柱狀圖圖4 FSH暴露不同時間Foxo3a的相對表達(dá)

3 討論

顆粒細(xì)胞表面有豐富的FSH受體(FSHR)，F(xiàn)SH與FSHR結(jié)合后引起胞內(nèi)cAMP水平增加，進(jìn)而激活蛋白激酶A(PKA)，PKA通過直接磷酸化或間接激活其他多個信號通路調(diào)控，包括cAMP響應(yīng)原件結(jié)合蛋白(CREB)、甾體激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)、骨形成蛋白(BMPs)等多個蛋白，促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖和甾體激素的合成[6-7]。

近來發(fā)現(xiàn)FSH與顆粒細(xì)胞中miRNA表達(dá)調(diào)控和功能密切相關(guān)。本課題組早期研究發(fā)現(xiàn)一系列miRNA在卵泡發(fā)育中呈現(xiàn)差異表達(dá)，并受到FSH調(diào)控[8]。Fiedler 等[5]利用實(shí)時定量RT-PCR研究發(fā)現(xiàn)FSH介導(dǎo)的小鼠排卵前和排卵期卵泡顆粒細(xì)胞miR-21的表達(dá)升高。Yin等[9]證明FSH能夠抑制ICR雌性大鼠顆粒細(xì)胞中miR-320的表達(dá)，而miR-320過表達(dá)部分抑制了FSH誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞增殖。Sirotkin 等[10]首次探討miRNA對顆粒細(xì)胞增殖及甾體激素合成影響。本文根據(jù)FSH刺激前后原代顆粒細(xì)胞miRNA芯片的結(jié)果，分析了原代顆粒細(xì)胞用FSH處理后miR-132的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)FSH刺激miR-132表達(dá)升高，與芯片篩查結(jié)果一致。文獻(xiàn)報(bào)道，在cAMP處理的大鼠顆粒細(xì)胞和促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)暴露的腎上腺中觀察到miR-132的表達(dá)上調(diào)[11]，在LH介導(dǎo)的排卵期小鼠的壁狀顆粒細(xì)胞中miR-132的表達(dá)上調(diào)[5]。Hu等[12]證明miR-132在原代大鼠卵巢顆粒細(xì)胞通過cAMP/PKA信號通路上調(diào)，并直接作用于靶基因StAR，在甾體激素生物合成的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。提示FSH可能通過cAMP/PKA通路上調(diào)miR-132的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)miR-132過表達(dá)促進(jìn)FSH介導(dǎo)的卵巢顆粒細(xì)胞孕酮的合成，進(jìn)一步驗(yàn)證了miRNA對顆粒細(xì)胞孕酮合成的調(diào)控。

叉頭基因轉(zhuǎn)錄因子家族(Foxo)是參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、自噬、能量代謝等細(xì)胞功能的一類重要的超級蛋白家族，F(xiàn)oxo3a是該家族研究最受關(guān)注的成員，F(xiàn)oxo3a在卵泡發(fā)育中發(fā)揮重要作用[13]。Liu等[14]證明干細(xì)胞因子(SCF)可以通過Foxo3a的磷酸化(失活)阻止大鼠卵母細(xì)胞的凋亡，提示Foxo3a參與調(diào)控卵巢卵母細(xì)胞的凋亡和原始卵泡的形成。孟春花等[15]發(fā)現(xiàn)Foxo3a基因可抑制豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Foxo3a可通過降低BMP-15和Smad蛋白抑制小鼠顆粒細(xì)胞增殖[16]，以及在體外培養(yǎng)環(huán)境中Foxo3a基因上調(diào)細(xì)胞Bim等凋亡相關(guān)蛋白活性導(dǎo)致大鼠卵巢顆粒細(xì)胞以細(xì)胞凋亡為主[17]。Ahmet 等[18]報(bào)道m(xù)iR-212/132通過靶向負(fù)調(diào)控Foxo3a抑制心肌肥厚。Wong等[19]證明miR-132的兩個關(guān)鍵靶蛋白PTEN和Foxo3a均與蛋白激酶B(AKT)信號通路相關(guān)，且在原代神經(jīng)元中miR-132缺失時上調(diào)。Kim等[20]研究炎癥性腸病患者的模型證明miR-132和miR-223通過負(fù)性調(diào)控Foxo3a增強(qiáng)炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，在FSH處理顆粒細(xì)胞不同時間點(diǎn)，F(xiàn)oxo3a表達(dá)呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，與miR-132的表達(dá)模式呈現(xiàn)反相關(guān)，提示在FSH介導(dǎo)的顆粒細(xì)胞甾體激素合成中miR-132可能負(fù)調(diào)控了Foxo3a的表達(dá)。

綜上，本研究表明miR-132能夠促進(jìn)卵泡刺激素介導(dǎo)的卵巢顆粒細(xì)胞P的合成，其機(jī)制可能與負(fù)調(diào)卵泡發(fā)育相關(guān)基因Foxo3a表達(dá)相關(guān)。筆者在上述研究的基礎(chǔ)上，將探索miR-132調(diào)控甾體激素的分子機(jī)制以及與FSH調(diào)控甾體激素合成的其他已鑒定的通路的關(guān)系，進(jìn)一步揭示miR-132在卵巢顆粒細(xì)胞甾體激素合成中的分子機(jī)制。