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        CIAPIN1和Fibulin-3在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)及其臨床意義

        2019-10-14 11:47:14馬建鋒李守賓張朝華王海江邵麗軍袁曉菲
        現(xiàn)代泌尿外科雜志 2019年9期
        關(guān)鍵詞:水平檢測(cè)

        馬建鋒,黎 瑋,李守賓,張朝華,王海江,邵麗軍,袁曉菲,沙 泉

        (1.保定市第一醫(yī)院泌尿外科,河北保定 071000,2.河北醫(yī)科大第二醫(yī)院泌尿外科,河北石家莊 050000,3.河北省人民醫(yī)院泌尿外科,河北石家莊 050057)

        膀胱癌(bladder cancer,BC)是泌尿生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一,嚴(yán)重威脅患者的生命與健康[1]。臨床上超過90%的膀胱癌患者為尿路上皮癌,其分為非浸潤(rùn)性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer,NMIBC)和肌層浸潤(rùn)性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer,MIBC)。MIBC患者預(yù)后極差,其5年生存率不足50%[2]。因此,尋找可以提示腫瘤發(fā)生發(fā)展的預(yù)示因子,并進(jìn)行早期診斷及治療成為降低膀胱癌死亡率的有效手段之一。凋亡抑制因子1(cytokine-induced apoptosis inhibitor 1,CIAPIN1)是一種新型的細(xì)胞凋亡抑制因子,可以對(duì)抗細(xì)胞凋亡[3]。研究表明,CIAPIN1可以抑制由多種刺激因素所導(dǎo)致的凋亡,并且促進(jìn)細(xì)胞增殖從而在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[3-4]。Fibulin-3屬于含表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)的纖維蛋白樣細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(又稱 EFEMP1),是由人類EFEMP1基因編碼的蛋白質(zhì)[5]。研究表明,F(xiàn)ibulin-3在多種腫瘤表達(dá)中上調(diào)[6],而最近研究報(bào)道,F(xiàn)ibulin-3可以促進(jìn)肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的進(jìn)展[7],預(yù)示著該基因在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要作用。本研究通過熒光定量PCR、Western blot實(shí)驗(yàn)及相關(guān)性分析,探討CIAPIN1和Fibulin-3在膀胱癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。

        1 材料與方法

        1.1 組織標(biāo)本自2012年3月至2017年12月,收集河北省保定市第一醫(yī)院泌尿外科住院患者臨床手術(shù)取下的膀胱癌組織和同一患者的癌旁組織各98例。其中男性51例,女性47例;年齡中位數(shù)為65歲,≤65歲者47例,>65歲者51例;TNM分期Ta~T1期者(NMIBC)51例,T2~T4期者(MIBC)47例;腫瘤≤3 cm者45例,>3 cm者53例;組織學(xué)分級(jí)grade Ⅰ者48例,grade Ⅱ~Ⅲ者50例;64例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,34例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。所有配對(duì)癌旁組織標(biāo)本均無腫瘤殘留或合并其他膀胱疾病,以上樣本均有完整臨床資料。

        1.2 RNA提取及實(shí)時(shí)定量PCR膀胱癌及癌旁組織(約100 mg)分別加入1 mL RNA裂解液經(jīng)組織研磨管冰上裂解。培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)沖洗后直接加入1 mL RNA裂解液,總RNA提取參照Total mRNA Extract kit (Omiga)操作手冊(cè),用Nano2000(Thermo Fisher)核酸定量?jī)x檢測(cè)RNA的純度和濃度。按照Invitrogen公司用于qRT-PCR的M-MLV第一鏈合成系統(tǒng)操作說明,取5 μg總RNA建立20 μL使用隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄體系合成cDNA。繼之,使用Invitrogen公司的Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG with ROX試劑盒和ABI 7500 Fast Real-time PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行熒光擴(kuò)增,利用以下引物檢測(cè)CIAPIN1和Fibulin-3的mRNA表達(dá),CIAPIN1-F:5′ GAG CTG CTG GAT CCA GAA GAT TTG AAG 3′,CIAPIN1-R:5′ CAG GTA GCA GTT TCC ACA AGC TGAC 3′;Fibulin-3-F:5′ GCC AGT GCT GCT GCA GTC GCA GGC 3′,F(xiàn)ibulin-3-R:5′ GCT CTA CAG TTG TGC GTC CCT GCA GTG 3′;GAPDH-F:5′ GGG TGT GAA CCA TGA GAA GTA TGAC 3′,GAPDH-R:5′ GTG GTC ATG AGT CCT TCC ACG ATA CC 3′。PCR結(jié)果采用相對(duì)定量法比較Ct值,以GAPDH作的Ct值為內(nèi)參,采用ΔCt(Ct目的-Ct內(nèi)參)法進(jìn)行相對(duì)定量分析,用2-ΔCt計(jì)算公式計(jì)算所得值作為目的RNA的相對(duì)表達(dá)量。

        1.3 蛋白提取及Western blot分別取膀胱癌及癌旁組織(約100 mg)加入1 mL 蛋白裂解液和10 μL 100 mg/mL 的苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)蛋白酶抑制劑,冰上操作經(jīng)研磨裂解。離心收集蛋白質(zhì)上清液,用改良的Lowry法進(jìn)行蛋白定量。取等量蛋白樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳完畢,取出凝膠進(jìn)行半干轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完畢,取出聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,置于含5%脫脂奶粉的TTBS(10 mmol/L tris-HCl,pH 8.0,150 mmol/L NaCl,0.05% tween-20)封閉液中,于室溫封閉2 h后進(jìn)行CIAPIN1 (proteintech,12638-1-AP),F(xiàn)ibulin-3(sc-365224)一抗4 ℃過夜、次日二抗結(jié)合反應(yīng)1 h。最后用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)抗體結(jié)合區(qū)帶,以β-actin為內(nèi)參基因。

        1.4 免疫雙熒光檢測(cè)蛋白表達(dá)膀胱癌及癌旁組織經(jīng)石蠟包埋后切片5 μm厚,常規(guī)脫蠟至水,抗原修復(fù)后室溫冷卻,10%山羊血清封閉,滴加CIAPIN1 (proteintech,12638-1-AP)和Fibulin-3(sc-365224)1∶50比例稀釋的一抗,4 ℃過夜,次日熒光二抗(兔紅、鼠綠)室溫孵育30 min,滴加DAPI染細(xì)胞核??篃晒馑p封片劑避光封片,激光共聚焦顯微鏡觀察、照相。

        2 結(jié) 果

        2.1 CIAPIN1和Fibulin-3 mRNA在膀胱癌及癌旁組織中的表達(dá)以同一患者的癌旁組織作為對(duì)照,GAPDH為內(nèi)參,采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)CIAPIN1和Fibulin-3 mRNA的表達(dá)情況。與對(duì)照組相比,CIAPIN1和Fibulin-3 mRNA水平在膀胱癌組織中的表達(dá)顯著增加(P<0.01,圖1)。CIAPIN1在膀胱癌組織和癌旁組中的表達(dá)分別為4.223±0.986 和2.054±0.866 (P<0.05);Fibulin-3 在膀胱癌組織和癌旁組中的表達(dá)率分別為5.284±1.586 和1.981± 0.937 (P<0.05)。

        2.2 免疫印跡檢測(cè)CIAPIN1和Fibulin-3在膀胱癌組織中的表達(dá)通過Western blot檢測(cè)膀胱癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織的蛋白表達(dá)情況,與癌旁組織相比,CIAPIN1和Fibulin-3的蛋白水平在膀胱癌組織中的表達(dá)顯著上調(diào),而其內(nèi)參基因β-actin在癌組織和癌旁組織中表達(dá)均沒有明顯的變化(圖2A)。我們將Western blot的結(jié)果進(jìn)行灰度值掃描,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,CIAPIN1和Fibulin-3的蛋白水平在膀胱癌組織中的表達(dá)顯著增加(P<0.05,圖2B)。

        2.3 免疫熒光檢測(cè)CIAPIN1和Fibulin-3在組織樣本中的表達(dá)利用免疫熒光檢測(cè)CIAPIN1和Fibulin-3的蛋白水平在臨床樣本組織中的表達(dá),與癌旁組織相比,CIAPIN1和Fibulin-3的蛋白水平在膀胱癌組織中的表達(dá)顯著上調(diào),而且在CIAPIN1高表達(dá)的組織位置Fibulin-3的表達(dá)同樣增加(圖3)。

        圖1 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)膀胱癌及癌旁組織中CIAPIN1和Fibulin-3的mRNA表達(dá)量

        A:CIAPIN1的mRNA在膀胱癌及癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量;B:Fibulin-3的mRNA在膀胱癌及癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量;*與癌旁組織(P)比較,P<0.01。

        圖2 Western blot檢測(cè)CIAPIN1和Fibulin-3在膀胱癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

        A:免疫印跡顯示CIAPIN1和Fibulin-3在膀胱癌組織和癌旁組織中的表達(dá);B:統(tǒng)計(jì)學(xué)分析CIAPIN1蛋白相對(duì)表達(dá)量;C:統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Fibulin-3蛋白相對(duì)表達(dá)量;*與癌旁組織(P)比較,P<0.05。

        圖3 免疫熒光檢測(cè)CIAPIN1和Fibulin-3在膀胱癌及癌旁組織中的表達(dá)

        2.4 CIAPIN1和Fibulin-3的表達(dá)與膀胱癌臨床病理特征的關(guān)系將98例膀胱癌患者的不同臨床病理因素與相應(yīng)的CIAPIN1和Fibulin-3 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行配對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)CIAPIN1和Fibulin-3的表達(dá)在不同性別和年齡個(gè)體之間沒有差異(P>0.05),但與癌癥的病理分級(jí)呈正相關(guān)(P<0.05),在TNM臨床分期中,T2及以上患者CIAPIN1和Fibulin-3的表達(dá)顯示高于T2以下等級(jí)(P<0.05)。淋巴轉(zhuǎn)移患者樣本中CIAPIN1和Fibulin-3的表達(dá)同樣高于非轉(zhuǎn)移個(gè)體(P<0.05,表1)。

        表1 膀胱癌中CAIPIN1和Fibulin-3表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 [例(%)]

        CIAPIN1:凋亡抑制因子1。

        2.5 CIAPIN1和Fibulin-3的轉(zhuǎn)錄水平在膀胱癌組織中呈正相關(guān)關(guān)系通過Graphpad prism 5軟件對(duì)上述qRT-PCR檢測(cè)到膀胱組織中CIAPIN1和Fibulin-3的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,兩者的Pearson’scorrelation相關(guān)性系數(shù)r=0.2577,而且在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性差異(P=0.03),CIAPIN1與Fibulin-3的mRNA表達(dá)在膀胱組織中存在線性相關(guān)關(guān)系(圖4)。

        圖4 CAIPIN1和Fibulin-3在膀胱癌組織中表達(dá)的相關(guān)性

        3 討 論

        膀胱癌位于全身惡性腫瘤發(fā)病率的第8位,在泌尿系統(tǒng)腫瘤中發(fā)生率最高。盡管我國(guó)膀胱癌的發(fā)病檢出率較歐洲低,但隨著人口平均壽命的逐年遞增、醫(yī)療水平的提高,疾病的檢出水平提升,加之環(huán)境污染對(duì)人體致病風(fēng)險(xiǎn)的日益加重等,我國(guó)膀胱癌的發(fā)病率呈逐年增加的趨勢(shì)[8]。對(duì)于早期膀胱癌患者,治療手段相對(duì)簡(jiǎn)單而且效果明顯,但是對(duì)于大多數(shù)中晚期患者,治療效果不佳。篩選膀胱癌的標(biāo)志基因,有助于我們及早發(fā)現(xiàn)病情,而深入研究膀胱癌的發(fā)病機(jī)制,在基因水平尋找膀胱癌的發(fā)病基因,將為膀胱癌診治提供重要的臨床價(jià)值。

        CIAPIN1位于人染色體16q13,包含8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子,由939 bp編碼成312個(gè)氨基酸,分子量為16.5 ku。在大多數(shù)人類血液惡性腫瘤和實(shí)體瘤中都會(huì)發(fā)現(xiàn)CIAPIN1表達(dá)異常[9-10]。CIAPIN1表達(dá)的上調(diào)或下調(diào),取決于不同的組織、器官或腫瘤[11],因?yàn)檫@與不同的調(diào)控機(jī)制、不同的基因表達(dá)水平或?qū)哟斡嘘P(guān),所以更值得我們對(duì)CIAPIN1在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中的機(jī)制進(jìn)行研究。敲低CIAPIN1顯著抑制K562細(xì)胞的胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶5(extracellular-regulated kinase 5,ERK5)和核轉(zhuǎn)錄因子-kappa B(nuclear factor-kappa B,NF-κB)信號(hào)途徑[9]。此外,microRNA-143還可以通過抑制CIAPIN1逆轉(zhuǎn)紫杉醇誘導(dǎo)的人乳腺癌細(xì)胞耐藥性[12]。然而CIAPIN1在膀胱癌中的表達(dá)及其作用尚不清楚。從臨床樣本中我們首先檢測(cè)CIAPIN1的表達(dá),實(shí)時(shí)定量PCR顯示,在膀胱癌組織中CIAPIN1的基因轉(zhuǎn)錄水平顯著高于同一患者的癌旁組織(P<0.01),Western blots同樣檢測(cè)到CIAPIN1蛋白質(zhì)表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05),表明CIAPIN1的表達(dá)水平可能與膀胱癌臨床病情的發(fā)展程度存在相關(guān)性。

        Fibulin-3的蛋白質(zhì)是EFEMP1基因的表達(dá)產(chǎn)物,其包含串聯(lián)重復(fù)的EGF樣序列,還包含C末端纖維蛋白型結(jié)構(gòu)域。研究表明,F(xiàn)ibulin-3在惡性膠質(zhì)瘤中上調(diào),可能在腫瘤侵襲性中發(fā)揮作用[13]。Fibulin-3基因啟動(dòng)子中表觀遺傳改變的擴(kuò)展預(yù)測(cè)了胰膽管導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀黏液性腫瘤的形成[14]。另一方面,有研究表明Fibulin-3通過ERK1/2活性調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrixmetalloproteinases 2,MMP2)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrixmetalloproteinases 9,MMP9),抑制肝細(xì)胞癌的遷移[15]。miRNA-143的上調(diào)通過抑制細(xì)胞因子誘導(dǎo)的CIAPIN1逆轉(zhuǎn)人乳腺癌細(xì)胞的耐藥性[12]。最近有報(bào)道,F(xiàn)ibulin-3可以促進(jìn)MIBC的進(jìn)展[16]。從基因的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平2個(gè)層次,我們均證實(shí)Fibulin-3在膀胱癌組織中表達(dá)上調(diào),預(yù)示著該基因在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要作用,而檢測(cè)Fibulin-3表達(dá)可以作為膀胱癌的發(fā)生發(fā)展提示因子。

        WANG等[9]在白血病K562細(xì)胞中研究發(fā)現(xiàn),敲低CIAPIN1能顯著降低ERK5磷酸化和NF-κB活性。而Fibulin-3在腫瘤微環(huán)境中需要NF-κB活化的方式促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲[17]。因此,我們猜測(cè)CIAPIN1和Fibulin-3之間的相關(guān)性是通過NF-κB來介導(dǎo)完成。總之,CAIPIN1和Fibulin-3在膀胱癌中表達(dá)均上調(diào),聯(lián)合檢測(cè)可能增加膀胱癌診斷的準(zhǔn)確率。CAIPIN1和Fibulin-3在腫瘤的發(fā)生過程中可能存在相互調(diào)控,然而確切的機(jī)制目前還不是很清楚,它們之間的關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。

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