王芳

(渮澤醫(yī)學?？茖W校內科學教研室，山東 菏澤 274000)

腫瘤干細胞是存在于腫瘤中的具有干細胞特性的細胞，文獻報道發(fā)現在神經母細胞瘤(NB)組織和細胞中存在腫瘤干細胞〔1，2〕，而且NB惡化程度與腫瘤干細胞的比例密切相關〔3〕。CD133作為腫瘤干細胞標志物，廣泛應用于神經干細胞及腫瘤干細胞的分選及鑒定。叉頭框轉錄因子O亞族(FOXO)1作為腫瘤抑制轉錄因子，廣泛存在于人體組織器官，如心、腦、胎盤、肺、肝、骨骼肌、前列腺、卵巢、小腸、結腸、外周血白細胞等〔4〕。在腫瘤組織如NB、前列腺癌〔5〕、乳腺癌〔6〕、肝癌〔7〕等中表達下調，參與腫瘤組織發(fā)生發(fā)展。既往研究發(fā)現FOXO1參與神經干細胞〔8〕和精原干細胞〔9〕干性維持，但有關FOXO1調控NB細胞分化的研究目前尚無報道。本研究通過免疫組化及Western印跡法檢測不同臨床分期、病理類型NB組織中FOXO1和CD133表達情況，并分析兩者的相關性。

1 材料和方法

1.1臨床材料及標本采集 選取菏澤醫(yī)學?？茖W校附屬醫(yī)院病理科2012年5月至2017年8月入院經術后切除NB石蠟組織塊標本53例為病例組，均通過組織病理學檢查確診。另選取癌旁正常組織27例為對照組。病例組臨床分期：其中1期12例、2期10例、3期13例、4期10例，4S期8例。

1.2試劑及耗材 FOXO1兔抗人單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，兔抗人CD133單克隆抗體購自Abcam公司，免疫組織化學SP染色試劑盒二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑購于北京中杉金橋生物有限公司。

1.3免疫組化染色 每個石蠟包塊連續(xù)切片5張，每張切片放置兩片組織、厚度4～5 μm，1張行蘇木素-伊紅(HE)染色復查診斷。采用SP法進行組織染色，實驗操作按照試劑盒使用說明書進行:組織切片使用二甲苯脫蠟8 min×3次，應用不同濃度梯度乙醇溶液水化組織切片后在蒸餾水中洗滌3 min×3次，加入高壓鍋于121℃×5 min高壓抗原修復并自然降溫至室溫，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后加入0.3%過氧化氫阻斷組織內源性過氧化物酶活性處理30 min，PBS洗滌后滴加一抗4℃孵育過夜，PBS清洗10 min×3次，滴加二抗常溫孵育1 h，PBS清洗10 min×3次，滴加DAB顯色液顯色，蘇木素復染后脫水、封片。陰性對照為使用PBS代替一抗處理組織切片。

1.4免疫組化結果判定 免疫組化染色處理組織切片，置于顯微鏡下觀察拍照。FOXO1以胞核染色棕色者表示陽性，CD133以胞膜染色棕色者表示陽性。隨機選取高倍鏡(400倍)3～4個視野拍照，統(tǒng)計不同視野下100個腫瘤細胞中FOXO1或CD133表達陽性細胞數，依據FOXO1或CD133表達陽性細胞所占比例判斷NB的FOXO1或CD133表達水平:其中陰性(-)<5%、弱陽性(+)6%～25% 、 中度陽性()26%～50% 、 強 陽 性()>50%。

1.5Western印跡檢測組織中FOXO1和CD133蛋白表達 兩組組織切小塊置入研磨器中，加入RIPA蛋白裂解液研磨，轉移至1.5 ml離心管，震蕩混勻30 s，冰上靜置10 min，4℃、15 000 r/min離心15 min，提取上清總蛋白后重復上述離心，提取上清總蛋白。留取5 μl定量，其余加入6×上樣緩沖液(1∶5體積比)后在沸水中煮沸5 min變性。取30 μg蛋白上樣，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進行電泳分離，用110 V電壓2 h將凝膠上的蛋白轉至硝酸纖維素(NC)膜上。50 g/L脫脂奶粉將膜封閉1 h后,將膜置于特定一抗，4℃搖床上孵育過夜。次日使用TBST洗膜液10 min/次洗3次并置于相應的二抗，常溫搖床慢速孵育1 h，10 min/次洗3次后使用電化學發(fā)光(ECL)顯影液進行顯影，目的蛋白表達量通過與內參蛋白β-actin標準化后得到相對比值。

1.6統(tǒng)計學分析 使用SPSS19.0軟件進行多因素方差分析、χ2檢驗、Pearson相關性分析。

2 結 果

2.1兩組FOXO1和CD133蛋白表達 免疫組化結果顯示，FOXO1蛋白染色陽性呈棕黃色顆粒，主要定位于細胞核，少數胞質中亦可見表達。在病例組中有21例表達陽性者，陽性率為39.6%(21/53)，其中弱陽性(+)8例，中度陽性()8例，強陽性()5例。FOXO1蛋白在對照組中有19例表達陽性者，陽性率為70.4%(19/27)，其中弱陽性(+)5例，中度陽性()7例，強陽性()7例。見圖1。對照組FOXO1蛋白表達陽性率顯著高于病例組(P<0.05)。經免疫組化染色發(fā)現，CD133蛋白陽性棕黃色顆粒主要定位于胞膜及胞質中，在病例組中陽性表達率為64.2%(34/53)，弱陽性(+)14例，中 度 陽 性()8例，強陽性()12例。同時，CD133蛋白在對照組中陽性率為37.0%(10/27)，其中弱陽性(+)4例，中度陽性()3例，強陽性()3例，見圖1。病例組中CD133陽性率顯著高于對照組(P<0.05)。

2.2病例組FOXO1和CD133表達陽性率與病理指標的關系 病例組不同臨床分期、病理分型及組織類型FOXO1、CD133表達陽性率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

圖1 兩組FOXO1和CD133陽性表達(×400)

分類nFOXO1χ2值P值CD133χ2值P值臨床分期1～2期2213(59.1)6.581<0.0512(54.5)16.764<0.053～4期235(21.7)18(78.3)4S期83(37.5)4(50.0)組織類型NB4215(35.7)25.013<0.0530(71.4)69.281<0.05GNB116(54.5)4(36.4)病理分型預后良好型2115(71.4)14.504<0.059(42.9)23.536<0.05預后不良好型326(18.7)25(78.1)

2.3Western印跡檢測FOXO1和CD133蛋白表達 NB組織未檢測到FOXO1蛋白表達或表達極弱，而癌旁組織中FOXO1不同程度表達；NB組織CD133不同程度表達，而癌旁組織中CD133表達明顯減弱，見圖2。進一步經Image-J軟件灰度值分析提示，NB組織和癌旁組織中FOXO1、CD133表達差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

N1、N2、N3:癌旁組織；C1、C2、C3:NB組織；表2同圖2 Western印跡檢測FOXO1、CD133表達

組別FOXO1CD133N10.98±0.031.05±0.03C10.21±0.021)2.04±0.031)N20.97±0.021.07±0.04C20.05±0.012)7.75±0.142)N30.98±0.031.00±0.01C30.04±0.013)6.68±0.173)

與N1組比較：1)P<0.05;與N2組比較：2)P<0.05;與N3組比較：3)P<0.05

2.4FOXO1和CD133表達的相關性分析 53例NB患者中FOXO1和CD133表達均陽性者為7例，均陰性者5例；FOXO1表達陽性，CD133表達陰性者18例；FOXO1表達陰性，CD133表達陽性者23例。經過Pearson等級相關分析:FOXO1和CD133的表達呈顯著負相關(r=-0.68,P<0.05)。

3 討 論

腫瘤干細胞具有無限增殖、多向分化潛能和高度自我更新能力，常是引起腫瘤異質性的重要因素〔10〕。腫瘤干細胞數量較少，然而可在腫瘤的發(fā)生、轉移、復發(fā)及后期腫瘤耐藥中起到重要作用。研究發(fā)現腫瘤干細胞存在于NB中，Meany等〔11〕對41例NB細胞使用Hoechst染料進行染色處理，通過流式細胞儀方法對NB腫瘤細胞進行干細胞分選處理，在18例NB腫瘤細胞成功篩選出干細胞群。因此，深入研究NB干細胞發(fā)生及發(fā)展機制，對于NB治療和預防將具有重要意義。

FOXO1蛋白在多種腫瘤中異常表達，是胰島素/胰島素樣生長因子信號通路的關鍵分子，上游受磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)磷酸化級聯通路的調節(jié)，下游調節(jié)的靶基因與細胞周期、細胞凋亡、侵襲轉移及干細胞等有關。其表達及活性在多種水平受到調節(jié)，如轉錄水平、翻譯水平、翻譯后修飾及蛋白酶體降解等。FOXO1作為轉錄因子存在于細胞核內，當被上游調控分子磷酸化后轉移至胞質中，無法激活下游靶基因，從而不能發(fā)揮轉錄因子功能〔12〕。本研究通過免疫組化發(fā)現，FOXO1蛋白在NB中明顯低表達，同時Western印跡結果進一步證明了FOXO1在NB中處于低表達水平，提示抑癌蛋白FOXO1在NB發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要作用。進一步分析FOXO1蛋白與NB的臨床分期、組織類型和病理分型之間存在明顯相關性，提示FOXO1蛋白表達可能影響NB生物學特性。

CD133是細胞膜蛋白，作為造血和某些正常組織干細胞標志物特異性標志物存在。研究發(fā)現，全身多種臟器組織如心、腦、腎臟等存在CD133的mRNA轉錄本，此外神經嵴干細胞中也發(fā)現CD133的存在，Chen等〔1〕使用流式細胞分離技術從腦細胞中提取到CD133+表型、具有干細胞特性的細胞。近些年來，CD133已經被廣泛應用于腫瘤干細胞的特異性標記，并且在NB中證實存在CD133陽性表達的腫瘤干細胞。將CD133+表達神經腫瘤干細胞通過注射方法種植于免疫缺陷小鼠皮下，結果全部免疫缺陷小鼠存在腦腫瘤成瘤〔13〕，同樣將CD133-表達神經腫瘤細胞種植于免疫缺陷小鼠皮下，卻難以引起小鼠腦腫瘤成瘤〔14〕。本研究結果發(fā)現，CD133在NB組織中陽性表達，且隨臨床分期增加，CD133陽性率呈現遞增趨勢。此外Western印跡結果進一步證明了CD133在NB中處于高表達水平。

關于FOXO1與CD133之間是否存在關聯性，Song等〔15〕在胰腺導管腺癌中發(fā)現FOXO1低表達的腫瘤細胞具有明顯干細胞特性且CD133處于高表達狀態(tài)，而FOXO1高表達的腫瘤細胞細胞干性明顯減弱且CD133表達明顯下調，推測CD133可能是FOXO1下游靶基因，FOXO1很可能通過調節(jié)CD133表達來調控腫瘤細胞干細胞特性。本研究中，通過免疫組織化學染色方法檢測兩者，使用蛋白水平作為綜合尺度來推測兩者表達之間的相關性，通過結果分析得知FOXO1和CD133在蛋白水平存在明顯負相關性，與既往胰腺癌中的研究呈現相似結果，推測NB干細胞特性可能通過FOXO1表達下調引起CD133蛋白水平升高來控制。

近年來分子靶向治療在很多腫瘤疾病中取得突破性進展，本研究證實在NB組織中FOXO1和CD133異常表達且與臨床分期及腫瘤發(fā)生發(fā)展存在密切聯系，并存在明顯負相關性，認為以兩者為靶點進行綜合性治療對于NB治療將會取得更佳療效。