趙鵬偉 柳嚴(yán) 劉延 張佳偉 劉江偉 黃建釗

(貴州省人民醫(yī)院肝膽外科，貴州 貴陽 550002)

膽囊癌屬于消化系統(tǒng)的惡性腫瘤，其致死率高于多數(shù)消化道惡性腫瘤，近年來，膽囊癌分子發(fā)病機(jī)制越來越受到廣大學(xué)者的關(guān)注，研究基因在膽囊癌發(fā)病中的作用也是目前提高膽囊癌治療的重要途徑〔1，2〕。睪丸蛋白聚糖(SPOCK)1在腫瘤中異常表達(dá)，其編碼的蛋白屬于骨黏連蛋白家族成員，與細(xì)胞形態(tài)維持、增殖等有關(guān)〔3，4〕。近年來的研究表明，SPOCK1沉默后可以發(fā)揮抗腫瘤作用，對(duì)于食管癌、膠質(zhì)瘤、膽囊癌等細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移具有抑制作用，并且沉默SPOCK1還可以誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡〔5～7〕。本研究旨在探討SPOCK1沉默后膽囊癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡情況，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 膽囊癌細(xì)胞GBC-SD購(gòu)自美國(guó)ATCC；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子(STAT)3抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam；剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase)-抗體購(gòu)自美國(guó)BOSTER；膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-FITC/碘化丙啶(PI)凋亡測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天研究所；Real time PCR試劑盒購(gòu)自大連TAKARA；磷酸化的STAT3(p-STAT3)抗體、SPOCK1抗體購(gòu)自美國(guó)CST；Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)invitrogen；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京TIANGEN；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶；SPOCK1 siRNA和siRNA control購(gòu)自美國(guó)biorbyt。

1.2細(xì)胞分組轉(zhuǎn)染 膽囊癌細(xì)胞密度為80%時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染前用不含血清的培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)細(xì)胞1 d。轉(zhuǎn)染操作步驟參照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000。膽囊癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SPOCK1 siRNA和siRNA control后記為干擾組和陰性組，并以不做轉(zhuǎn)染的膽囊癌細(xì)胞記為對(duì)照組。膽囊癌細(xì)胞培養(yǎng)于37℃，5% CO2和95%空氣的培養(yǎng)箱內(nèi)，細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶消化傳代，用10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)。

1.3Real Time PCR法測(cè)定膽囊癌細(xì)胞中SPOCK1的轉(zhuǎn)錄水平 對(duì)照組、陰性組、干擾組的膽囊癌細(xì)胞在分別培養(yǎng)2 d以后，用Trizol試劑提取各組膽囊癌細(xì)胞內(nèi)的總RNA，RNA保存于-80℃。取RNA，進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄后，用Real Time PCR測(cè)定SPOCK1水平。2-△△Ct法計(jì)算，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參。引物序列：SPOCK1正義鏈5′-CATGGGTTGGACCTTCGA-3′，反義鏈5′-CTTTGGTGGCTCAGGCTCT-3′。GAPDH正義鏈5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′，反義鏈5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。

1.4Western印跡測(cè)定膽囊癌細(xì)胞中SPOCK1蛋白表達(dá)水平 對(duì)照組、陰性組、干擾組的膽囊癌細(xì)胞分別培養(yǎng)2 d以后，收集各組膽囊癌細(xì)胞，加入蛋白裂解液，放置在冰上裂解約30 min以后，在低溫離心機(jī)10 000 r/min離心15 min。用移液槍吸取上清，按照BCA法對(duì)蛋白進(jìn)行定量檢測(cè)。以每孔上樣孔添加40 μg蛋白進(jìn)行電泳，在電泳前，蛋白樣品與等體積的上樣緩沖液在100℃煮沸，以90 V電壓電泳，待染料進(jìn)入到凝膠的底部時(shí)，終止電泳。將凝膠上的蛋白電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，轉(zhuǎn)膜條件為：90 V，4℃。把膜放在5%牛血清白蛋白中室溫孵育1 h，然后把膜放在1∶600稀釋的一抗中孵育過夜以后，再將膜放在1∶2 000稀釋的二抗中室溫孵育2 h。DAB顯色以后，用Gel Doc2000對(duì)各目的條帶進(jìn)行定量，以GAPDH為內(nèi)參。

1.5噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)膽囊癌細(xì)胞增殖 MTT是一種黃色的染料，其可以被活細(xì)胞產(chǎn)生的乳酸脫氫酶還原，形成難溶解的藍(lán)紫色結(jié)晶，而這種結(jié)晶物的產(chǎn)生量同活細(xì)胞的數(shù)目呈正相關(guān)，檢測(cè)其在490 nm的A值可以反映出活細(xì)胞的數(shù)量。對(duì)照組、陰性組、干擾組的膽囊癌細(xì)胞種植到96孔板，接種密度約為每孔添加3 000個(gè)細(xì)胞，在2 d后添加MTT，每孔20 μl，置于37℃孵育3 h。把上清吸盡以后，按照每孔添加100 μl的二甲基亞砜(DMSO)把結(jié)晶溶解以后，測(cè)定490 nm的A值。

1.6細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)膽囊癌細(xì)胞克隆形成能力 細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞的增殖能力，單個(gè)細(xì)胞在經(jīng)過約6代的增殖以后，可以形成一個(gè)細(xì)胞群體，成為克隆，當(dāng)一個(gè)克隆內(nèi)的細(xì)胞數(shù)目大于50時(shí)，可用肉眼直接觀察到克隆。對(duì)照組、陰性組、干擾組的膽囊癌細(xì)胞種植到24孔板內(nèi)(用不含血清的培養(yǎng)液懸浮)，每個(gè)孔中添加約200個(gè)細(xì)胞，約14 d以后，用PBS清洗各孔，用多聚甲醛固定以后，吉姆薩染色。計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)目。用克隆形成數(shù)目占接種細(xì)胞數(shù)目的百分比表示克隆形成率。

1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)膽囊癌細(xì)胞凋亡情況 對(duì)照組、陰性組、干擾組的膽囊癌細(xì)胞在分別培養(yǎng)2 d以后，收集各組細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)加入結(jié)合緩沖液500 μl，再依次添加5 μl的Annexin V-FITC和5 μl的PI，混合以后，把細(xì)胞放在避光條件下，孵育結(jié)合15 min。用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定各組膽囊癌細(xì)胞凋亡情況。在結(jié)果中右上象限和右下象限表示凋亡的細(xì)胞，左上象限表示壞死的細(xì)胞，左下象限表示正常的細(xì)胞。

1.8Western印跡法檢測(cè)膽囊癌細(xì)胞中STAT3、Cleaved Caspase-3、p-STAT3蛋白水平 對(duì)照組、陰性組、干擾組的膽囊癌細(xì)胞在分別培養(yǎng)2 d以后，按照Western印跡法測(cè)定各組膽囊癌細(xì)胞中STAT3、Cleaved Caspase-3、p-STAT3蛋白水平，一抗稀釋：STAT3以1∶800稀釋、Cleaved Caspase-3以1∶600稀釋、p-STAT3以1∶600稀釋。

1.9統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS21.0軟件行t檢驗(yàn)、單因素方差分析及SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1轉(zhuǎn)染后的膽囊癌細(xì)胞中的SPOCK1 mRNA和蛋白水平 膽囊癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SPOCK1 siRNA后，細(xì)胞中SPOCK1 mRNA和蛋白水平均明顯降低，而膽囊癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA control對(duì)細(xì)胞中SPOCK1 mRNA和蛋白水平?jīng)]有影響。SPOCK1 siRNA可以明顯下調(diào)膽囊癌細(xì)胞中SPOCK1轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。見圖1，表1。

圖1 Western印跡檢測(cè)膽囊癌細(xì)胞中SPOCK1蛋白表達(dá)

組別SPOCK1 mRNASPOCK1蛋白對(duì)照組1.00±0.000.75±0.06陰性組1.02±0.130.74±0.08干擾組0.52±0.041)0.22±0.061)F/P值38.984/0.00060.816/0.000

與對(duì)照組比較：1)P<0.05，下表同

2.2SPOCK1敲低后降低膽囊癌細(xì)胞增殖和克隆形成能力 膽囊癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SPOCK1 siRNA后，細(xì)胞A值、細(xì)胞克隆形成率明顯下降，而膽囊癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA control后對(duì)膽囊癌細(xì)胞A值和克隆形成率都沒有影響。SPOCK1敲低后可以明顯下調(diào)膽囊癌細(xì)胞增殖和克隆形成能力。見表2。

表2 各組膽囊癌細(xì)胞A值和細(xì)胞克隆形成率比較

2.3敲低SPOCK1促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞凋亡發(fā)生 對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為〔(6.35±1.58)%〕,膽囊癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SPOCK1 siRNA后，細(xì)胞凋亡率〔(22.17±3.54)%〕明顯升高，而膽囊癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA control后〔(6.82±1.65)%〕對(duì)膽囊癌細(xì)胞的凋亡沒有影響。SPOCK1敲低后可以明顯促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞凋亡。見圖2。

2.4敲低SPOCK1 促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞中Caspase-3活化并減少STAT3磷酸化 膽囊癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SPOCK1 siRNA后，細(xì)胞中Cleaved Caspase-3水平升高，而p-STAT3水平下調(diào)，而膽囊癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA control后對(duì)膽囊癌細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、p-STAT3水平?jīng)]有影響。SPOCK1敲低后可以明顯促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞中Caspase活化，抑制STAT3磷酸化。見圖3，表3。

圖2 Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)各組膽囊癌細(xì)胞凋亡

圖3 Western印跡測(cè)定各組膽囊癌細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、STAT3、p-STAT3蛋白水平

組別Cleaved Caspase-3STAT3p-STAT3對(duì)照組0.37±0.041.06±0.140.58±0.06陰性組0.38±0.061.08±0.120.57±0.08干擾組0.93±0.111)1.06±0.070.21±0.031)F/P值53.428/0.0000.031/0.97036.688/0.000

3 討 論

SPOCK1最初發(fā)現(xiàn)于睪丸中，屬于一種嵌合多糖，因此被命名為睪丸蛋白聚糖1，后來隨著研究的不斷深入，SPOCK1存在于除了睪丸之外的組織中，因此也稱為Sparc/骨礦化結(jié)合素，其在多種物種中均有表達(dá)，是一個(gè)高度保守的多糖蛋白〔8，9〕。SPOCK1參與腫瘤的發(fā)生，與細(xì)胞與細(xì)胞之間的黏附作用有關(guān)，可以通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的基質(zhì)金屬蛋白酶影響多種腫瘤的轉(zhuǎn)移〔10〕。已經(jīng)有研究證實(shí)，SPOCK1在膽囊癌中表達(dá)上調(diào)，并且參與膽囊癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲過程〔3，7〕。在肺癌中發(fā)現(xiàn)，SPOCK1表達(dá)水平異常升高，并且能夠調(diào)控肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，同樣在胃癌、膀胱癌等癌癥中發(fā)現(xiàn)SPOCK1異常高表達(dá)，并且與腫瘤預(yù)后、分期等有關(guān)〔11～13〕。近年來的研究顯示，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中沉默SPOCK1后，腫瘤細(xì)胞凋亡增多，SPOCK1還與腫瘤細(xì)胞的凋亡有關(guān)〔5〕。

細(xì)胞凋亡的發(fā)生是機(jī)體正常的生理功能的一部分，是清除細(xì)胞的主動(dòng)途徑，當(dāng)細(xì)胞凋亡途徑發(fā)生紊亂時(shí)，就會(huì)引起機(jī)體發(fā)育異常，出現(xiàn)多種疾病。腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，腫瘤發(fā)生常常伴隨著腫瘤細(xì)胞凋亡異常減少的現(xiàn)象，如何誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡也是腫瘤治療的重要途徑〔14〕。Caspase-3以酶原的形式存在于細(xì)胞中，其N端含有一個(gè)較短的前區(qū)，沒有死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域，必須通過活化后才可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，Caspase-3酶原中含有一個(gè)由3個(gè)天冬氨酸(ASP)組成的安全扣，當(dāng)細(xì)胞凋亡發(fā)生時(shí)，這個(gè)安全扣在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)裂解，在ASP內(nèi)被剪切，形成活化形式的Cleaved Caspase-3，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而Caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程幾乎存在于所有的腫瘤細(xì)胞中〔15～17〕。本實(shí)驗(yàn)表明，SPOCK1沉默后可以誘導(dǎo)膽囊癌細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Caspase-3的活化，減少膽囊癌細(xì)胞的增殖和克隆，SPOCK1沉默可以抑制膽囊癌的發(fā)展。

癌基因和抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生，癌基因過度表達(dá)和抑癌基因表達(dá)減少是腫瘤發(fā)生的基礎(chǔ)。細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖等與細(xì)胞內(nèi)多種細(xì)胞因子和信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，是一個(gè)極為復(fù)雜的過程〔18〕。STAT3在腫瘤組織中異常激活，其激活后可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，減少腫瘤細(xì)胞凋亡〔19〕。研究顯示，膽囊癌組織中STAT3磷酸化水平異常升高，并且細(xì)胞內(nèi)多種基因和藥物調(diào)控膽囊癌細(xì)胞的生長(zhǎng)均與STAT3信號(hào)通路有關(guān)〔20～22〕。本研究提示SPOCK1沉默可能通過抑制STAT3信號(hào)通路影響膽囊癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡，其具體的作用機(jī)制還需要在以后進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上，SPOCK1沉默可以減弱膽囊癌細(xì)胞的增殖和克隆能力，誘導(dǎo)Caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，抑制STAT3信號(hào)通路的激活，SPOCK1沉默可以發(fā)揮抗膽囊癌生長(zhǎng)的作用，而對(duì)于其分子機(jī)制尚不清楚，還需要在以后深入研究，為靶向SPOCK1治療膽囊癌提供堅(jiān)實(shí)的參考。