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        CD133+和CD133-膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫瘤干細(xì)胞的lncRNA表達(dá)譜

        2019-10-14 07:44:44陳竹周太光薛麗陳佳
        中國(guó)老年學(xué)雜志 2019年19期
        關(guān)鍵詞:差異

        陳竹 周太光 薛麗 陳佳

        (1西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,四川 瀘州 464000;綿陽(yáng)市中心醫(yī)院 2兒科;3檢驗(yàn)科)

        腦膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤,約占顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤總數(shù)的70%,其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)是惡性程度最高的組織學(xué)類(lèi)型,具有發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高、死亡率高和治愈率低的特點(diǎn)〔1〕。近年來(lái),無(wú)論是顯微手術(shù)、放化療還是免疫治療均取得了巨大進(jìn)步,但GBM患者的預(yù)后仍不理想。2016年,世界衛(wèi)生組織(WHO)整合了分子分型的膠質(zhì)瘤分型系統(tǒng),在原有組織學(xué)基礎(chǔ)上加入了分子分型,優(yōu)化了原有的基于組織病理學(xué)的分型系統(tǒng),新分型將GBM患者分為異檸檬酸脫氫酶(IDH)野生型與IDH突變型,前者約占90%,表明在這一分型標(biāo)準(zhǔn)下患者之間仍存在較大的異質(zhì)性,目前急需分子層面的更精準(zhǔn)的分層診斷與治療〔2〕。研究表明在人類(lèi)GBM內(nèi)存在GBM干細(xì)胞(GSC)亞群〔3~5〕,Lan等〔6〕發(fā)現(xiàn)腫瘤增殖異質(zhì)性是由同種群的GSC及其GSC后代隨機(jī)突變所決定,表明腫瘤干細(xì)胞不僅驅(qū)動(dòng)著腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā),還決定著腫瘤細(xì)胞之間的異質(zhì)性。研究發(fā)現(xiàn)GBM經(jīng)多次培養(yǎng)分離獲得的具有自我更新能力的腫瘤干細(xì)胞,表現(xiàn)出兩種不同的生物行為學(xué)表現(xiàn),一類(lèi)表現(xiàn)為高增殖指數(shù),形成典型神經(jīng)球狀生長(zhǎng),免疫組化顯示CD133+;另一類(lèi)表現(xiàn)為相對(duì)較低的增殖,形成黏附生長(zhǎng)球伴隨有分化細(xì)胞,免疫組化顯示CD133-〔7〕。

        隨著大規(guī)模的二代測(cè)序技術(shù)應(yīng)用,越來(lái)越多的腫瘤驅(qū)動(dòng)基因被發(fā)現(xiàn),推動(dòng)了膠質(zhì)瘤的分子分型的發(fā)展〔8,9〕。此外,深度的測(cè)序技術(shù)還發(fā)現(xiàn)了一類(lèi)新分子,即長(zhǎng)鏈非編碼(lnc)RNA,在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中也起到重要作用〔10,11〕。LncRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度超過(guò)200 bp,缺乏開(kāi)放閱讀框架的mRNA樣轉(zhuǎn)錄本,多種lncRNA被報(bào)道與膠質(zhì)瘤相關(guān)。如經(jīng)典的同源框(HOX)轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOTAIR),其高表達(dá)與GBM的不良預(yù)后相關(guān),并可通過(guò)表觀遺傳學(xué)、miR-141等途徑調(diào)控髓細(xì)胞增生原癌基因(C-myc)的激活,推進(jìn)腫瘤的發(fā)展〔12~14〕。本研究旨在探索CD133+和CD133-兩類(lèi)腫瘤干細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄水平上的差異,并分析了lncRNA 長(zhǎng)鏈脂肪酸延伸酶2翻譯RNA(ELOVL2-AS1)的臨床意義。

        1 材料和方法

        1.1材料 32例GBM組織標(biāo)本取自西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院,臨床標(biāo)本均經(jīng)病理檢驗(yàn)證實(shí),患者均簽署知情同意書(shū),本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核通過(guò),并持續(xù)定期隨訪(fǎng)。標(biāo)本于手術(shù)后迅速轉(zhuǎn)移至液氮保存。從腫瘤基因組圖譜計(jì)劃(TCGA)下載具有完整臨床資料及二代RNA測(cè)序表達(dá)譜資料的GBM患者共149例。

        1.2LncRNA的重注釋 在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載GDS2728數(shù)據(jù)集下的GBM表達(dá)譜原始數(shù)據(jù)(cel格式文件),標(biāo)準(zhǔn)化和背景校正使用RobustMultichip Average法(RMA,Windows版),并使用GAT Explorer〔15〕對(duì)其進(jìn)行重注釋?zhuān)崛∑渲械膌ncRNA,形成表達(dá)譜。

        1.3實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) 取于液氮中保存的膠質(zhì)瘤組織0.1~0.2 g,RNeasy mini kit(Qiagen公司,德國(guó))提取總RNA,于-80℃保存,按照PrimeScript RT reagent (TaKaRa公司)使用說(shuō)明,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,隨后使用SYBR Premix Ex TaqⅡ (Tli RNaseH Plus;TaKaRa公司)進(jìn)行PCR反應(yīng),ELOVL2-AS1引物:上游:5′-AGGACATAGTGAGAAGGT-3′,下游:5′-ATCAAGTTGCCAGAAGAG-3′,CD133引物:上游:5′-GTCCTCTTCTCTTCTCAA-3′,下游:5′-CTCTGTCCATATTCTCCAT-3′,由Invitrogen公司合成。

        1.4共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 構(gòu)建基于加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(WGCNA)方法的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò),相較于一般的Pearson相關(guān)系數(shù)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,該方法更符合一般生物基因表達(dá)模式〔16,17〕。將軟閾值設(shè)定為0.99,并使用K中心值法鑒定共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中的核心轉(zhuǎn)錄本,K值越大說(shuō)明轉(zhuǎn)錄本越重要。

        1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 差異lncRNA的分析采用R軟件的limma包,采用SPSS24.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn),Kaplan-Meier法繪制生存曲線(xiàn),組間比較進(jìn)行Log-Rank檢驗(yàn)。

        2 結(jié) 果

        2.1來(lái)源于原發(fā)GBM的CD133+和CD133-腫瘤干細(xì)胞的差異基因表達(dá)譜 共計(jì)1 250個(gè)差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本,其中差異表達(dá)的lncRNA為151個(gè)(差異倍數(shù)≥1,P<0.05,見(jiàn)圖1A),CD133+組相對(duì)CD133-組上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本為638個(gè),下調(diào)612個(gè)。聚類(lèi)熱圖顯示,CD133+與CD133-GBM干細(xì)胞的mRNA和lncRNA表達(dá)譜存在顯著差異(圖1B、1C)。

        A:CD133+組表達(dá)圖;B:所有差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本的聚類(lèi)熱圖;C:差異倍數(shù)在前50的lncRNA聚類(lèi)熱圖圖1 GBM CD133+與CD133-腫瘤干細(xì)胞差異基因表達(dá)譜

        2.2差異表達(dá)基因的功能分析 Beier等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)上述兩類(lèi)腫瘤干細(xì)胞之間存在顯著的生物行為學(xué)上的差異,為初步探索差異基因所主導(dǎo)的功能差異,本研究使用基因本體論(GO)分析了差異基因的主要功能〔錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05〕,見(jiàn)表1,發(fā)現(xiàn)CD133+組下調(diào)基因最富集的GO條目為主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅱ類(lèi)蛋白復(fù)合體〔18,19〕。

        2.3lncRNA/mRNA的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò) 轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中諸多轉(zhuǎn)錄本相互作用形成了復(fù)雜的互作網(wǎng)絡(luò),具有相近功能的基因具有類(lèi)似的基因表達(dá)形式?;谠摾碚?,共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)通過(guò)可視化的方法有效地易化了該轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò),并有助于提取出關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄本。通過(guò)WGCNA分析,本研究構(gòu)建了共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)(圖2A),該網(wǎng)絡(luò)包含1 148個(gè)節(jié)點(diǎn)及3 237對(duì)關(guān)系構(gòu)成,并形成了數(shù)個(gè)重要的子網(wǎng)絡(luò)。最重要的子網(wǎng)絡(luò)已被突出顯示,該子網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的節(jié)點(diǎn)均具有最高的K值,應(yīng)為該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心子網(wǎng)絡(luò),該子網(wǎng)絡(luò)內(nèi)包含凸素(PROM)1基因即CD133,進(jìn)一步證實(shí)了CD133在兩種不同生物學(xué)特性的腫瘤干細(xì)胞之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中具有重要的調(diào)控作用。磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(PLTP)是具有最高K值的lncRNA,在該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中處于重要地位(圖2B)。

        表1 差異表達(dá)基因富集的GO條目(%)

        A:基于WGCNA的差異基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò),圖中重點(diǎn)展示了K值大于14的核心子網(wǎng)絡(luò),該子網(wǎng)絡(luò)包含CD133基因;B:共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中K值排名前30的轉(zhuǎn)錄本圖2 差異轉(zhuǎn)錄本的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)及網(wǎng)絡(luò)核心基因分析

        2.4LncRNA ELOVL2-AS1在GBM中的臨床意義探究 為進(jìn)一步明確lncRNA ELOVL2-AS1在GBM中的臨床意義,首先對(duì)隨訪(fǎng)時(shí)間<30 d的TCGA患者進(jìn)行撿剔,在剩余142例患者中分析了該lncRNA的臨床意義,平均(60.97±12.70)歲,男91例,女51例。IDH突變患者的ELOVL2-AS1表達(dá)水平較低(P<0.001),其他臨床資料下的患者無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表2。ELOVL2-AS1高表達(dá)患者中位總生存時(shí)間顯著低于低表達(dá)患者(10.87個(gè)月 vs 12.21個(gè)月,P=0.025),見(jiàn)圖3A。納入年齡、性別進(jìn)行校正,并建立風(fēng)險(xiǎn)積分模型:風(fēng)險(xiǎn)得分=0.031×年齡(歲)+0.362×ELOVL2-AS1(0:低表達(dá),1:高表達(dá))。

        隨后,本研究使用qRT-PCR檢測(cè)了2015~2018年本院收治的32例GBM患者的ELOVL2-AS1與CD133的表達(dá)水平,平均(57.2±8.70)歲,男20例,女12例。ELOVL2-AS1與CD133表達(dá)呈中度相關(guān)(Pearson相關(guān)系數(shù)=0.618,P=0.000),見(jiàn)圖3B。風(fēng)險(xiǎn)積分高者中位生存時(shí)間顯著低于低得分者(6.21個(gè)月vs 13.31個(gè)月,P=0.02),見(jiàn)圖3C。

        表2 142例TCGA來(lái)源GBM患者ELOVL2-AS1表達(dá)與臨床資料分析

        A:在142例TCGA的GBM患者中,高、低表達(dá)ELOVL2-AS1組的生存曲線(xiàn);B:經(jīng)PCR檢測(cè)的32例GBM患者中ELOVL2-AS1與CD133的相關(guān)性;C:32例GBM患者基于前述風(fēng)險(xiǎn)積分公式的不同風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組的預(yù)后單因素分析圖3 lncRNA ELOVL2-AS1的臨床意義

        3 討 論

        由于腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性,腫瘤細(xì)胞逐漸獲得的耐藥性仍是目前腫瘤治療領(lǐng)域的一大難題。研究認(rèn)為,腫瘤干細(xì)胞是導(dǎo)致耐藥的主要誘因,通過(guò)靶向腫瘤干細(xì)胞可有效地控制腫瘤〔20〕。CD133是一種包含5次跨膜區(qū)域的糖蛋白,被認(rèn)為可作為多種癌癥的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物〔21~23〕,但同時(shí)也有研究表明腫瘤干細(xì)胞全能性并不一定受限于CD133+,甚至CD133-細(xì)胞的集落生成能力要強(qiáng)于前者〔24〕。

        早在2004年,Singh等〔25〕就使用CD133作為標(biāo)志物,成功從成神經(jīng)管細(xì)胞瘤和膠質(zhì)瘤中獲取了腫瘤干細(xì)胞。近年Beier等〔7〕研究發(fā)現(xiàn),原發(fā)GBM經(jīng)培養(yǎng)可獲得CD133+和CD133-兩種細(xì)胞集落,兩種細(xì)胞集落均有腫瘤特性,所不同的是CD133+細(xì)胞呈現(xiàn)神經(jīng)球樣生長(zhǎng),與之相對(duì)應(yīng)的CD133-集落包含多種分化細(xì)胞,呈現(xiàn)黏附生長(zhǎng)特性,且前者的增殖及遷移能力顯著強(qiáng)于后者。臨床研究進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)論,CD133可作為腦腫瘤患者預(yù)后總生存及無(wú)病生存的預(yù)測(cè)指標(biāo)〔26~29〕。

        基因芯片分析揭示了CD133+和CD133-細(xì)胞之間調(diào)控基因的差異。通過(guò)對(duì)表達(dá)譜的初步分析,本研究發(fā)現(xiàn)了MHCⅡ類(lèi)分子在CD133-細(xì)胞上高表達(dá),可能與腫瘤細(xì)胞的免疫及細(xì)胞黏附相關(guān),一定程度解釋了其黏附生長(zhǎng)的特點(diǎn)。在顯著差異表達(dá)的lncRNA中,不乏近年來(lái)被證實(shí)在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用的lncRNA,如lncRNA H19,被證實(shí)可通過(guò)調(diào)控miR-675的表達(dá),進(jìn)而負(fù)調(diào)控靶基因Cadherin 13的表達(dá),影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力〔30,31〕。

        脂代謝異常與腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移有著密切的聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)“轉(zhuǎn)移起始細(xì)胞”對(duì)脂質(zhì)代謝有著極強(qiáng)依懶性并表達(dá)高活性CD36受體,從而有效攝取脂肪酸〔32〕。ELOVL基因的諸多成員與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),如ELOVL7可促進(jìn)前列腺腫瘤細(xì)胞的增殖〔33〕,ELOVL6的高表達(dá)可致乳腺癌、肝癌的不佳預(yù)后〔34,35〕。ELOVL2-AS1是通過(guò)構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)獲取的在CD133+腫瘤干細(xì)胞中顯著高表達(dá)的關(guān)鍵lncRNA,理論上可順式調(diào)控其對(duì)應(yīng)靶mRNA,ELOVL2是長(zhǎng)鏈脂肪酸合成的限速酶之一,涉及多種多不飽和脂肪酸的合成〔36,37〕。該基因通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝,在乳腺癌、結(jié)腸癌與前列腺癌中發(fā)揮重要調(diào)控作用〔38~40〕。

        本研究提示了ELOVL2-AS1作為風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)因子及CD133相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的可能。但ELOVL2-AS1調(diào)節(jié)ELOVL2基因進(jìn)而調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝,參與CD133+腫瘤干細(xì)胞的驅(qū)動(dòng),影響患者預(yù)后這一假設(shè)有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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