陳竹 周太光 薛麗 陳佳

(1西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州 464000；綿陽(yáng)市中心醫(yī)院 2兒科；3檢驗(yàn)科)

腦膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤，約占顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤總數(shù)的70%，其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)是惡性程度最高的組織學(xué)類(lèi)型，具有發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高、死亡率高和治愈率低的特點(diǎn)〔1〕。近年來(lái)，無(wú)論是顯微手術(shù)、放化療還是免疫治療均取得了巨大進(jìn)步，但GBM患者的預(yù)后仍不理想。2016年，世界衛(wèi)生組織(WHO)整合了分子分型的膠質(zhì)瘤分型系統(tǒng)，在原有組織學(xué)基礎(chǔ)上加入了分子分型，優(yōu)化了原有的基于組織病理學(xué)的分型系統(tǒng)，新分型將GBM患者分為異檸檬酸脫氫酶(IDH)野生型與IDH突變型，前者約占90%，表明在這一分型標(biāo)準(zhǔn)下患者之間仍存在較大的異質(zhì)性，目前急需分子層面的更精準(zhǔn)的分層診斷與治療〔2〕。研究表明在人類(lèi)GBM內(nèi)存在GBM干細(xì)胞(GSC)亞群〔3～5〕，Lan等〔6〕發(fā)現(xiàn)腫瘤增殖異質(zhì)性是由同種群的GSC及其GSC后代隨機(jī)突變所決定，表明腫瘤干細(xì)胞不僅驅(qū)動(dòng)著腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)，還決定著腫瘤細(xì)胞之間的異質(zhì)性。研究發(fā)現(xiàn)GBM經(jīng)多次培養(yǎng)分離獲得的具有自我更新能力的腫瘤干細(xì)胞，表現(xiàn)出兩種不同的生物行為學(xué)表現(xiàn)，一類(lèi)表現(xiàn)為高增殖指數(shù)，形成典型神經(jīng)球狀生長(zhǎng)，免疫組化顯示CD133+；另一類(lèi)表現(xiàn)為相對(duì)較低的增殖，形成黏附生長(zhǎng)球伴隨有分化細(xì)胞，免疫組化顯示CD133-〔7〕。

隨著大規(guī)模的二代測(cè)序技術(shù)應(yīng)用，越來(lái)越多的腫瘤驅(qū)動(dòng)基因被發(fā)現(xiàn)，推動(dòng)了膠質(zhì)瘤的分子分型的發(fā)展〔8，9〕。此外，深度的測(cè)序技術(shù)還發(fā)現(xiàn)了一類(lèi)新分子，即長(zhǎng)鏈非編碼(lnc)RNA，在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中也起到重要作用〔10，11〕。LncRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度超過(guò)200 bp，缺乏開(kāi)放閱讀框架的mRNA樣轉(zhuǎn)錄本，多種lncRNA被報(bào)道與膠質(zhì)瘤相關(guān)。如經(jīng)典的同源框(HOX)轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOTAIR)，其高表達(dá)與GBM的不良預(yù)后相關(guān)，并可通過(guò)表觀遺傳學(xué)、miR-141等途徑調(diào)控髓細(xì)胞增生原癌基因(C-myc)的激活，推進(jìn)腫瘤的發(fā)展〔12～14〕。本研究旨在探索CD133+和CD133-兩類(lèi)腫瘤干細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄水平上的差異，并分析了lncRNA 長(zhǎng)鏈脂肪酸延伸酶2翻譯RNA(ELOVL2-AS1)的臨床意義。

1 材料和方法

1.1材料 32例GBM組織標(biāo)本取自西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，臨床標(biāo)本均經(jīng)病理檢驗(yàn)證實(shí)，患者均簽署知情同意書(shū)，本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，并持續(xù)定期隨訪(fǎng)。標(biāo)本于手術(shù)后迅速轉(zhuǎn)移至液氮保存。從腫瘤基因組圖譜計(jì)劃(TCGA)下載具有完整臨床資料及二代RNA測(cè)序表達(dá)譜資料的GBM患者共149例。

1.2LncRNA的重注釋 在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載GDS2728數(shù)據(jù)集下的GBM表達(dá)譜原始數(shù)據(jù)(cel格式文件)，標(biāo)準(zhǔn)化和背景校正使用RobustMultichip Average法(RMA，Windows版)，并使用GAT Explorer〔15〕對(duì)其進(jìn)行重注釋?zhuān)崛∑渲械膌ncRNA，形成表達(dá)譜。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) 取于液氮中保存的膠質(zhì)瘤組織0.1～0.2 g，RNeasy mini kit(Qiagen公司，德國(guó))提取總RNA，于-80℃保存，按照PrimeScript RT reagent (TaKaRa公司)使用說(shuō)明，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，隨后使用SYBR Premix Ex TaqⅡ (Tli RNaseH Plus；TaKaRa公司)進(jìn)行PCR反應(yīng)，ELOVL2-AS1引物：上游：5′-AGGACATAGTGAGAAGGT-3′，下游：5′-ATCAAGTTGCCAGAAGAG-3′，CD133引物：上游：5′-GTCCTCTTCTCTTCTCAA-3′，下游：5′-CTCTGTCCATATTCTCCAT-3′，由Invitrogen公司合成。

1.4共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 構(gòu)建基于加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(WGCNA)方法的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，相較于一般的Pearson相關(guān)系數(shù)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，該方法更符合一般生物基因表達(dá)模式〔16，17〕。將軟閾值設(shè)定為0.99，并使用K中心值法鑒定共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中的核心轉(zhuǎn)錄本，K值越大說(shuō)明轉(zhuǎn)錄本越重要。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 差異lncRNA的分析采用R軟件的limma包，采用SPSS24.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)，Kaplan-Meier法繪制生存曲線(xiàn)，組間比較進(jìn)行Log-Rank檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1來(lái)源于原發(fā)GBM的CD133+和CD133-腫瘤干細(xì)胞的差異基因表達(dá)譜 共計(jì)1 250個(gè)差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本，其中差異表達(dá)的lncRNA為151個(gè)(差異倍數(shù)≥1，P<0.05，見(jiàn)圖1A)，CD133+組相對(duì)CD133-組上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本為638個(gè)，下調(diào)612個(gè)。聚類(lèi)熱圖顯示，CD133+與CD133-GBM干細(xì)胞的mRNA和lncRNA表達(dá)譜存在顯著差異(圖1B、1C)。

A:CD133+組表達(dá)圖；B:所有差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本的聚類(lèi)熱圖；C:差異倍數(shù)在前50的lncRNA聚類(lèi)熱圖圖1 GBM CD133+與CD133-腫瘤干細(xì)胞差異基因表達(dá)譜

2.2差異表達(dá)基因的功能分析 Beier等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)上述兩類(lèi)腫瘤干細(xì)胞之間存在顯著的生物行為學(xué)上的差異，為初步探索差異基因所主導(dǎo)的功能差異，本研究使用基因本體論(GO)分析了差異基因的主要功能〔錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05〕，見(jiàn)表1，發(fā)現(xiàn)CD133+組下調(diào)基因最富集的GO條目為主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅱ類(lèi)蛋白復(fù)合體〔18，19〕。

2.3lncRNA/mRNA的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò) 轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中諸多轉(zhuǎn)錄本相互作用形成了復(fù)雜的互作網(wǎng)絡(luò)，具有相近功能的基因具有類(lèi)似的基因表達(dá)形式?；谠摾碚?，共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)通過(guò)可視化的方法有效地易化了該轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并有助于提取出關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄本。通過(guò)WGCNA分析，本研究構(gòu)建了共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)(圖2A)，該網(wǎng)絡(luò)包含1 148個(gè)節(jié)點(diǎn)及3 237對(duì)關(guān)系構(gòu)成，并形成了數(shù)個(gè)重要的子網(wǎng)絡(luò)。最重要的子網(wǎng)絡(luò)已被突出顯示，該子網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的節(jié)點(diǎn)均具有最高的K值，應(yīng)為該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心子網(wǎng)絡(luò)，該子網(wǎng)絡(luò)內(nèi)包含凸素(PROM)1基因即CD133，進(jìn)一步證實(shí)了CD133在兩種不同生物學(xué)特性的腫瘤干細(xì)胞之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中具有重要的調(diào)控作用。磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(PLTP)是具有最高K值的lncRNA，在該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中處于重要地位(圖2B)。

表1 差異表達(dá)基因富集的GO條目(%)

A：基于WGCNA的差異基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，圖中重點(diǎn)展示了K值大于14的核心子網(wǎng)絡(luò)，該子網(wǎng)絡(luò)包含CD133基因；B：共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中K值排名前30的轉(zhuǎn)錄本圖2 差異轉(zhuǎn)錄本的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)及網(wǎng)絡(luò)核心基因分析

2.4LncRNA ELOVL2-AS1在GBM中的臨床意義探究 為進(jìn)一步明確lncRNA ELOVL2-AS1在GBM中的臨床意義，首先對(duì)隨訪(fǎng)時(shí)間<30 d的TCGA患者進(jìn)行撿剔，在剩余142例患者中分析了該lncRNA的臨床意義，平均(60.97±12.70)歲，男91例，女51例。IDH突變患者的ELOVL2-AS1表達(dá)水平較低(P<0.001)，其他臨床資料下的患者無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。ELOVL2-AS1高表達(dá)患者中位總生存時(shí)間顯著低于低表達(dá)患者(10.87個(gè)月 vs 12.21個(gè)月，P=0.025)，見(jiàn)圖3A。納入年齡、性別進(jìn)行校正，并建立風(fēng)險(xiǎn)積分模型：風(fēng)險(xiǎn)得分=0.031×年齡(歲)+0.362×ELOVL2-AS1(0：低表達(dá)，1：高表達(dá))。

隨后，本研究使用qRT-PCR檢測(cè)了2015～2018年本院收治的32例GBM患者的ELOVL2-AS1與CD133的表達(dá)水平，平均(57.2±8.70)歲，男20例，女12例。ELOVL2-AS1與CD133表達(dá)呈中度相關(guān)(Pearson相關(guān)系數(shù)=0.618，P=0.000)，見(jiàn)圖3B。風(fēng)險(xiǎn)積分高者中位生存時(shí)間顯著低于低得分者(6.21個(gè)月vs 13.31個(gè)月，P=0.02)，見(jiàn)圖3C。

表2 142例TCGA來(lái)源GBM患者ELOVL2-AS1表達(dá)與臨床資料分析

A：在142例TCGA的GBM患者中，高、低表達(dá)ELOVL2-AS1組的生存曲線(xiàn)；B：經(jīng)PCR檢測(cè)的32例GBM患者中ELOVL2-AS1與CD133的相關(guān)性；C：32例GBM患者基于前述風(fēng)險(xiǎn)積分公式的不同風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組的預(yù)后單因素分析圖3 lncRNA ELOVL2-AS1的臨床意義

3 討 論

由于腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性，腫瘤細(xì)胞逐漸獲得的耐藥性仍是目前腫瘤治療領(lǐng)域的一大難題。研究認(rèn)為，腫瘤干細(xì)胞是導(dǎo)致耐藥的主要誘因，通過(guò)靶向腫瘤干細(xì)胞可有效地控制腫瘤〔20〕。CD133是一種包含5次跨膜區(qū)域的糖蛋白，被認(rèn)為可作為多種癌癥的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物〔21～23〕，但同時(shí)也有研究表明腫瘤干細(xì)胞全能性并不一定受限于CD133+，甚至CD133-細(xì)胞的集落生成能力要強(qiáng)于前者〔24〕。

早在2004年，Singh等〔25〕就使用CD133作為標(biāo)志物，成功從成神經(jīng)管細(xì)胞瘤和膠質(zhì)瘤中獲取了腫瘤干細(xì)胞。近年Beier等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)GBM經(jīng)培養(yǎng)可獲得CD133+和CD133-兩種細(xì)胞集落，兩種細(xì)胞集落均有腫瘤特性，所不同的是CD133+細(xì)胞呈現(xiàn)神經(jīng)球樣生長(zhǎng)，與之相對(duì)應(yīng)的CD133-集落包含多種分化細(xì)胞，呈現(xiàn)黏附生長(zhǎng)特性，且前者的增殖及遷移能力顯著強(qiáng)于后者。臨床研究進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)論，CD133可作為腦腫瘤患者預(yù)后總生存及無(wú)病生存的預(yù)測(cè)指標(biāo)〔26～29〕。

基因芯片分析揭示了CD133+和CD133-細(xì)胞之間調(diào)控基因的差異。通過(guò)對(duì)表達(dá)譜的初步分析，本研究發(fā)現(xiàn)了MHCⅡ類(lèi)分子在CD133-細(xì)胞上高表達(dá)，可能與腫瘤細(xì)胞的免疫及細(xì)胞黏附相關(guān)，一定程度解釋了其黏附生長(zhǎng)的特點(diǎn)。在顯著差異表達(dá)的lncRNA中，不乏近年來(lái)被證實(shí)在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用的lncRNA，如lncRNA H19，被證實(shí)可通過(guò)調(diào)控miR-675的表達(dá)，進(jìn)而負(fù)調(diào)控靶基因Cadherin 13的表達(dá)，影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力〔30，31〕。

脂代謝異常與腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移有著密切的聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)“轉(zhuǎn)移起始細(xì)胞”對(duì)脂質(zhì)代謝有著極強(qiáng)依懶性并表達(dá)高活性CD36受體，從而有效攝取脂肪酸〔32〕。ELOVL基因的諸多成員與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，如ELOVL7可促進(jìn)前列腺腫瘤細(xì)胞的增殖〔33〕，ELOVL6的高表達(dá)可致乳腺癌、肝癌的不佳預(yù)后〔34，35〕。ELOVL2-AS1是通過(guò)構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)獲取的在CD133+腫瘤干細(xì)胞中顯著高表達(dá)的關(guān)鍵lncRNA，理論上可順式調(diào)控其對(duì)應(yīng)靶mRNA，ELOVL2是長(zhǎng)鏈脂肪酸合成的限速酶之一，涉及多種多不飽和脂肪酸的合成〔36，37〕。該基因通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝，在乳腺癌、結(jié)腸癌與前列腺癌中發(fā)揮重要調(diào)控作用〔38～40〕。

本研究提示了ELOVL2-AS1作為風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)因子及CD133相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的可能。但ELOVL2-AS1調(diào)節(jié)ELOVL2基因進(jìn)而調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，參與CD133+腫瘤干細(xì)胞的驅(qū)動(dòng)，影響患者預(yù)后這一假設(shè)有待進(jìn)一步研究證實(shí)。