任喜尚 楊潔 鄭鳳龍

(鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)系，河南 鄭州 450064)

胃癌死亡率居惡性腫瘤首位，近些年的發(fā)病率有上升趨勢(shì)〔1〕。腫瘤發(fā)生發(fā)展涉及多基因、多信號(hào)，已有多項(xiàng)研究表明基因異常表達(dá)可影響胃癌增殖、侵襲遷移和黏附〔2,3〕。上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是指上皮細(xì)胞在某些特定生理病理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)樣表型細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程〔4〕。EMT參與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、胚胎發(fā)育、組織纖維化等多種生理及病理過(guò)程。研究表明，發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞侵襲和遷移能力明顯增強(qiáng)，更易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及周圍組織浸潤(rùn)〔5〕。也有研究表明降低腫瘤細(xì)胞EMT可抑制細(xì)胞侵襲和遷移能力〔6〕。小泛素樣修飾物基因(SUMO)是存在于所有真核生物的保守序列，SUMO1P3是SUMO假基因家族一員，有研究表明，沉默胰腺癌細(xì)胞SUMO1P3表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力，可能與其抑制EMT過(guò)程有關(guān)〔7〕。胃癌細(xì)胞中SUMO1P3也呈高表達(dá)，其表達(dá)與腫瘤大小、分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)〔8〕，SUMO1P3對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)特性影響研究尚未清楚。本研究以慢病毒為載體沉默胃癌細(xì)胞SUMO1P3表達(dá)，旨在研究SUMO1P3基因?qū)ξ赴┘?xì)胞增殖、侵襲、遷移和黏附能力的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及慢病毒 人胃癌BGC-823細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。SUMO1P3 siRNA慢病毒載體由美國(guó)Sigma設(shè)計(jì)合成包裝。

1.2試劑和儀器 胎牛血清(FBS)、RPMI1640培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gibco；噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自美國(guó)Sigma；Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板及Matrigel膠均購(gòu)自美國(guó)BD；聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce；SUMO1P3、E-鈣黏蛋白(cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和α-SMA抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BIORAD。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) BGC-823細(xì)胞用含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，于5%體積分?jǐn)?shù)CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.4siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的BGC-823細(xì)胞，用綠色熒光染料CFSE標(biāo)記后以5×104/孔濃度接種細(xì)胞于6孔板，無(wú)抗生素的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞24 h，待細(xì)胞達(dá)40%～60%的匯合度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染參照LipofectamineTM RNAi MAX轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明。實(shí)驗(yàn)分組：空白組不作處理；NC組轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照病毒載體(把RNA干擾病毒所使用的干擾序列換成無(wú)序、無(wú)干擾作用的堿基)；si-SUMO1P3組轉(zhuǎn)染SUMO1P3基因的siRNA慢病毒載體。將含siRNA慢病毒及陰性對(duì)照病毒的轉(zhuǎn)染試劑與細(xì)胞共孵育5 h，加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)孵育，48 h后通過(guò)Western印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。

1.5轉(zhuǎn)染效果檢測(cè) 適量放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液常規(guī)提取轉(zhuǎn)染siRNA慢病毒的細(xì)胞總蛋白，BCA法定量蛋白。取50 μg蛋白上樣，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉膜后，加一抗(1∶500稀釋的SUMO1P3、E-cadherin、Vimentin和α-SMA抗體)4℃過(guò)夜，加二抗〔辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的1∶2 000稀釋的兔抗鼠IgG〕，37℃孵育1 h，TBST洗滌。加電化學(xué)發(fā)法(ECL)試劑，曝光3 min，暗室中顯影、定影。用Image-J軟件行圖像條帶灰度值分析。以GAPDH為內(nèi)參，SUMO1P3、E-cadherin、Vimentin和α-SMA與GAPDH灰度值比值為蛋白相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6細(xì)胞活力檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染siRNA慢病毒的BGC-823細(xì)胞接種于96孔板，每孔5×103個(gè)，轉(zhuǎn)染24、48、72 h，每孔加入MTT試劑(5 mg/ml)20 μl，37℃孵育4 h，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，震蕩5 min，酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm波長(zhǎng)吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 將500 μg Matrigel鋪在Transwell小室濾膜上，37℃孵育2 h使膠凝固。Transwell小室上室加100 μl轉(zhuǎn)染siRNA慢病毒48 h的細(xì)胞懸液，Transwell小室下室加600 μl含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)液，37℃孵育24 h，吸棄上室液體，棉簽輕拭掉Matrigel膠及未侵襲的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定及結(jié)晶紫染色后，使用倒置顯微鏡(×400)隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，取均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8細(xì)胞遷移能力檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)步驟大體同1.7，差異在于聚碳酸多孔濾膜表面未鋪Matrigel。

1.9細(xì)胞黏附力檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 胰酶消化轉(zhuǎn)染siRNA 慢病毒48 h的細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×104個(gè)/ml，接種細(xì)胞懸液于96孔，每孔100 μl，培養(yǎng)箱中孵育5、30、60 min，更換培養(yǎng)液，取出未貼壁細(xì)胞，MTT法檢測(cè)各個(gè)孔A值。方法同1.6。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組SUMO1P3蛋白表達(dá) si-SUMO1P3組SUMO1P3蛋白表達(dá)(0.052±0.005)明顯低于空白組(0.668±0.065，P<0.05)，NC組(0.679±0.068)與空白組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=130.613，P=0.000)，見圖1。

圖1 Western印跡檢測(cè)SUMO1P3蛋白表達(dá)

2.2各組BGC-823細(xì)胞活力比較 si-SUMO1P3組BGC-823細(xì)胞24、48、72 h細(xì)胞活力均顯著低于空白組(P<0.05)。見表1。

2.3各組BGC-823細(xì)胞侵襲和遷移能力比較 與空白組比較，si-SUMO1P3組細(xì)胞侵襲和遷移能力明顯降低(P<0.05)。見圖2，表2。

表1 各組BGC-823細(xì)胞活力比較

與空白組比較：1)P<0.05；下表同

圖2 抑制SUMO1P3表達(dá)對(duì)BGC-823細(xì)胞侵襲(×400)

組別細(xì)胞侵襲數(shù)細(xì)胞遷移數(shù)空白組202.3±11.4154.3±8.7NC組198.8±10.7150.1±7.2si-SUMO1P3組121.2±6.41)96.5±5.31)F/P值66.280/0.00060.064/0.000

2.4各組BGC-823細(xì)胞黏附能力比較 si-SUMO1P3組在接種30 min和60 min細(xì)胞黏附能力均明顯低于空白組(P<0.05)。見表3。

表3 各組BGC-823細(xì)胞黏附能力比較

2.5各組EMT相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與空白組比較，si-SUMO1P3組E-cadherin表達(dá)明顯升高，Vimentin和α-SMA表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見圖3、表4。

圖3 Western印跡檢測(cè)各組細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)

組別E-cadherinVimentinα-SMA空白組0.046±0.0060.578±0.0580.401±0.036NC組0.053±0.0080.592±0.0610.392±0.032si-SUMO1P3組0.487±0.0531)0.147±0.0181)0.076±0.0101)F值P值197.4320.00077.7400.000127.4150.000

3 討 論

腫瘤發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因、多階段、多因素的復(fù)雜過(guò)程，腫瘤相關(guān)基因與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，對(duì)腫瘤分子生物學(xué)特性及機(jī)制研究具有重要意義。SUMO是存在于所有真核生物的保守序列，有SUMO1、SUMO2、SUMO3和SUMO4 4條編碼蛋白基因，SUMO1、SUMO2和SUMO3在人體各種組織和細(xì)胞中廣泛存在，參與細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)、凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等細(xì)胞過(guò)程，SUMO1有8條假基因，SUMO1P3是SUMO假基因家族成員之一，研究表明SUMO1P3影響腫瘤發(fā)生發(fā)展〔9〕。研究顯示，膀胱癌SUMO1P3基因上調(diào)表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)及晚期TNM分期呈正相關(guān)，沉默SUMO1P3 表達(dá)可抑制癌細(xì)胞增殖、遷移和誘導(dǎo)凋亡〔10〕；結(jié)直腸癌中SUMO1P3表達(dá)明顯高于正常組織，沉默SUMO1P3表達(dá)可阻滯細(xì)胞于G1期，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔11〕。胃癌中SUMO1P3研究較少。有研究顯示，胃癌細(xì)胞中SUMO1P3也呈現(xiàn)高表達(dá)，其表達(dá)與腫瘤大小、分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)〔8〕。本研究旨在SUMO1P3表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲遷移及黏附能力的影響。

RNA干擾(RNAi)是由RNA雙鏈介導(dǎo)的在轉(zhuǎn)錄后沉默基因的現(xiàn)象，作為一種新的、強(qiáng)有力的研究工具，具有快速、高效、序列特異性及易操作等優(yōu)點(diǎn)，使用RNAi技術(shù)治療腫瘤、遺傳性疾病、炎癥等已成為研究熱點(diǎn)，目前RNAi技術(shù)在腫瘤方面研究已有迅速發(fā)展〔12,13〕，在胃癌治療中也取得了一定進(jìn)展。研究表明，通過(guò)RNAi技術(shù)抑制基因表達(dá)可降低胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)。如有RNAi介導(dǎo)的NOX4基因沉默可通過(guò)JAK激酶(JAK2)/信號(hào)轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄因子(STAT)3信號(hào)抑制胃癌細(xì)胞侵襲能力〔14〕；通過(guò)RNAi技術(shù)抑制肝腸鈣黏連蛋白(CDH17)基因表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔15〕。本研究結(jié)果顯示，SUMO1P3表達(dá)降低可抑制BGC-823細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及黏附力，提示抑制SUMO1P3表達(dá)可降低胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)。

EMT與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，通過(guò)EMT，上皮來(lái)源腫瘤細(xì)胞失去極性，細(xì)胞間黏附能力降低，同時(shí)獲得較高的侵襲遷移能力和抗凋亡能力，甚至降低細(xì)胞外基質(zhì)能力，使腫瘤細(xì)胞更易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移〔16,17〕。因此EMT是腫瘤進(jìn)展的重要環(huán)節(jié)。EMT過(guò)程發(fā)生依賴于E-cadherin等上皮表型蛋白表達(dá)下調(diào)，Vimentin、α-SMA等間質(zhì)表型相關(guān)蛋白過(guò)表達(dá)〔18〕。E-cadherin是EMT發(fā)生的重要標(biāo)志，在包括胃癌在內(nèi)的多種腫瘤中表達(dá)降低，低表達(dá)E-cadherin的胃癌患者生存期更短，而胃癌中重新表達(dá)E-cadherin可降低細(xì)胞侵襲和遷移能力〔19〕。侵襲遷移能力強(qiáng)、分化強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞Vimentin和α-SMA往往高表達(dá)，而抑制其表達(dá)可降低腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力〔20,21〕。本研究結(jié)果提示，SUMO1P3表達(dá)抑制可通過(guò)EMT途徑抑制胃癌細(xì)胞侵襲遷移。