黃 震， 胥志超， 張 波， 王紅燕， 陳 重， 白 冰， 潘偉光， 李桂秋， 徐廣健， 余治健， 鄧啟文， 李多云

(1. 深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬南山醫(yī)院感染科及內(nèi)源性感染診治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518052； 2. 深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院肺科門診,廣東 深圳 518101； 3. 深圳市醫(yī)院感染質(zhì)量控制中心，廣東 深圳 518052)

金黃色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus，SA)是引起醫(yī)院及社區(qū)感染的主要病原菌，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、心包炎和腦膜炎，甚至敗血癥、膿毒血癥等全身感染[1-2]。目前的研究大多關(guān)注的是耐甲氧西林金黃色葡萄球(methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)，然而，有相當(dāng)一部分的感染是由甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(methicillin-susceptibleStaphylococcusaureus, MSSA)引起。在我國，MSSA 感染約占SA感染的40%，SA血流感染近一半由MSSA引起[3]，國外有研究[4-5]也發(fā)現(xiàn)， MSSA引起的血流感染正在增多或至少處于穩(wěn)定狀態(tài)。有報(bào)道[6]認(rèn)為MSSA 攜帶的毒力因子編碼基因如殺白細(xì)胞素、溶血素、中毒性休克毒素以及葡萄球菌腸毒素等的比例要明顯高于MRSA。隨著大環(huán)內(nèi)酯類藥物在臨床上廣泛使用，SA對大環(huán)內(nèi)脂類-林可酰胺-鏈陽菌素B(macrolide-lincosamide-streptogramin B, MLSB)等耐藥日益嚴(yán)重。為解決細(xì)菌耐藥問題，SA對大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥的機(jī)制不斷被闡明，第三代大環(huán)內(nèi)酯類藥物酮內(nèi)酯類被開發(fā)出來。喹紅霉素(ABT-773)作為第二個(gè)開發(fā)的酮內(nèi)酯類藥物，被認(rèn)為療效并不差于克拉霉素及泰利霉素。其抗菌機(jī)制主要為與23S rRNA上A2058位點(diǎn)及Ⅱ區(qū)A752及Ⅴ區(qū)U2609位點(diǎn)結(jié)合，阻止細(xì)菌肽鏈的延伸[7-8]。目前，在國內(nèi)暫未發(fā)現(xiàn)喹紅霉素用于抗SA的相關(guān)研究報(bào)道，而且，大多數(shù)的分子分型研究側(cè)重于 MRSA，對于MSSA的分子流行特征所知有限。故本研究旨在了解臨床分離的MSSA對喹紅霉素體外敏感性，并與經(jīng)典大環(huán)內(nèi)酯類紅霉素相比較，以探討新型大環(huán)內(nèi)酯類藥物對MSSA抗菌效果的進(jìn)展，進(jìn)一步探討MSSA不同多位點(diǎn)序列分型(MLST)的型別與喹紅霉素對MSSA最低抑菌濃度(MIC)值之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 118株MSSA分離自深圳市南山醫(yī)院2011—2015年住院患者送檢的各種臨床標(biāo)本，標(biāo)本來源為痰38株(32.2%)，咽拭子26株(22.0%)，其他呼吸道分泌物16株(13.6%)， 血15株(12.7%)，穿刺液10株(8.5%)、膿液9株(7.6%)和傷口分泌物4株(3.4%)。其中，呼吸道來源共80株(67.8%)。科室來源為ICU 19株(16.1%)、急診觀察室15株(12.7%)、呼吸科14株(11.9%)、兒科及新生兒科14株(11.9%)及其他科室56株(47.5%)。

1.2 菌株鑒定與藥敏試驗(yàn) 所有菌株經(jīng)VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)(法國梅里埃公司)鑒定為MSSA，采用美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法及K-B紙片法進(jìn)一步測定所有藥物MIC值，主要藥物包括紅霉素、喹紅霉素、利福平、環(huán)丙沙星、阿莫西林/克拉維酸、阿米卡星、萬古霉素、利奈唑胺、呋喃妥因和替考拉寧，藥敏紙片、藥物和專用瓊脂由英國OXOID公司提供，質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC 25923。喹紅霉素折點(diǎn)參考2016年CLSI M100-S26 標(biāo)準(zhǔn)推薦泰利霉素對SA的折點(diǎn)：敏感(≤1 μg/mL)，中介(2 μg/mL)，耐藥(≥4 μg/mL)。耐藥率=(中介株數(shù)+耐藥株數(shù))/檢測株數(shù)×100%。

1.3 基因組DNA提取與純化 采用四段劃線方法分離MSSA， 選取單克隆菌株，經(jīng)液體培養(yǎng)基增菌后離心，采用DNeasy Blood & Tissue Kit DNA提取試劑盒按照革蘭陽性菌操作流程提取細(xì)菌基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 MLST 采用PCR的方法分別擴(kuò)增MSSA菌株的7個(gè)管家基因(arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi、yqiL)，其引物、反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參照MLST網(wǎng)站(http://Saureus.mlst.net/misc/info.asp)，目的基因402～516 bp，PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行測序，測序結(jié)果提交MLST網(wǎng)站(http://mlst.net)比對，與數(shù)據(jù)庫中的SA相應(yīng)基因的等位基因進(jìn)行比較，獲得每個(gè)管家基因的序號，然后按順序依次排列，最終確定MSSA臨床分離株的ST型。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用軟件SAS 9.4對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，耐藥率的比較采用χ2檢驗(yàn)及Fisher確切概率法，P≤0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MSSA的耐藥情況 118 株MSSA對喹紅霉素MIC值跨度從≤0.03 μg/mL到>16 μg/mL，中介2株，耐藥21株，耐藥率達(dá)19.5%，對紅霉素中介1株，耐藥70株，耐藥率高達(dá)60.2%，喹紅霉素及紅霉素對MSSA的MIC值分布見圖1。通過Fisher確切概率法比較前二者M(jìn)IC值分布，喹紅霉素對MSSA效果均優(yōu)于紅霉素(P<0.001)。MSSA對利福平、環(huán)丙沙星及阿米卡星耐藥率分別為3.4%、3.4%和1.7%；對利奈唑胺、萬古霉素、呋喃妥因、替考拉寧及阿莫西林/克拉維酸均100%敏感。見表1。

圖1 喹紅霉素及紅霉素對MSSA的MIC值分布

表1 臨床分離MSSA菌株對常用抗菌藥物的藥敏情況

S：敏感；I：中介；R：耐藥；MIC：最低抑菌濃度；MIC50/MIC90：分別為抑制50%和90%細(xì)菌生長時(shí)的最低藥物濃度

2.2 MSSA的MLST與喹紅霉素MIC值的關(guān)系 118株MSSA分為32個(gè)ST型，20株菌屬于MLST數(shù)據(jù)庫中未記載的新ST型(NT)。所有ST分型中無特別明顯的優(yōu)勢菌株，數(shù)量位于前三的ST型分別為：ST7型15株(12.7%)， ST188型12株(10.2%)，ST59型12株(10.2%)。12株ST188型MSSA對喹紅霉素均敏感，其余各不同ST型MSSA對喹紅霉素MIC值分布見表2。

表2 喹紅霉素對各ST型MSSA的MIC值分布

NT：新ST型； MIC：最低抑菌濃度；MIC50/90：分別為抑制50%和90%細(xì)菌生長時(shí)的最低藥物濃度

3 討論

SA是最常見的臨床分離革蘭陽性致病菌之一[2, 9]，該院SA主要來源于呼吸道標(biāo)本，其次是血標(biāo)本，科室集中在ICU和急診觀察室。由于大環(huán)內(nèi)酯類藥物同時(shí)對革蘭陽性球菌和支原體、衣原體等病原體有廣譜抗菌活性，故在臨床上被廣泛用于治療呼吸道感染，但隨之而來的是SA對MLSB耐藥率持續(xù)上升。在本研究中，MSSA對常用的抗SA藥物如阿莫西林/克拉維酸、呋喃妥因、萬古霉素、利奈唑胺、替考拉寧均100%敏感。對利福平、環(huán)丙沙星及阿米卡星亦高度敏感，僅少數(shù)菌株耐藥。該院MSSA對紅霉素耐藥率達(dá)60.2%，稍高于徐修禮等[10]于2008年開展的大規(guī)模調(diào)查研究結(jié)果。本研究MSSA對喹紅霉素耐藥率為19.5%，MSSA對喹紅霉素及紅霉素的MIC值主要分布在≤0.25 μg/mL及>16 μg/mL組，呈兩端分布，但喹紅霉素對MSSA體外敏感性強(qiáng)于紅霉素(P<0.001)。在國外相關(guān)研究[11]中，170株USA300克隆MRSA對喹紅霉素均敏感，也反映了喹紅霉素對SA的強(qiáng)效殺菌效果。SA對MLSB耐藥主要是由于攜帶了甲基化酶基因erm及質(zhì)粒介導(dǎo)的外排泵基因msr等[12]，但酮內(nèi)酯類藥物較MLSB類藥物作用位點(diǎn)更多，并且SA的外排泵不能對喹紅霉素進(jìn)行排出[13]，從而可部分對抗MLSB類藥物SA耐藥問題。

經(jīng)MLST發(fā)現(xiàn)，該院MSSA分為32個(gè)ST型，ST分型中并無特別明顯的優(yōu)勢菌株，與Liu等[6]調(diào)查結(jié)果一致，主要的ST型分別為：ST7、ST188、ST59和ST398，說明臨床分離的MSSA具有高度遺傳多樣性。在其他MSSA 流行病學(xué)研究報(bào)道中，主要流行型別因研究對象和地域的差異而呈現(xiàn)出差異性，其中 ST398、ST5、ST88、ST25、ST7和 ST188 等是中國較常見的流行型別[14-15]，而這些ST型別在該院均有發(fā)現(xiàn)。而SA的分子型別與其耐藥表型有一定的相關(guān)性，如ST398、ST7、ST5、ST59等是主要的MSSA多重耐藥克隆[16-17]，在本研究中，此4種型別對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥率亦較高。ST188、ST30、ST72、ST88、ST1及ST15對喹紅霉素均敏感，但由于其他型別樣本量均較小，故不具代表性。喹紅霉素對其余MLST型MSSA的MIC值分布無明顯特點(diǎn)。

SA的耐藥機(jī)制復(fù)雜，故本研究仍存在不足與局限性。首先，本研究未對更多的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素進(jìn)行體外敏感性對比研究；其次，本研究未對MSSA中erm基因及msr基因分布進(jìn)行進(jìn)一步調(diào)查，MSSA對喹紅霉素耐藥機(jī)制有待進(jìn)一步研究。再次，本研究樣本量較小，對MSSA的種群進(jìn)化進(jìn)行研究需要多中心、長期的動(dòng)態(tài)監(jiān)測，才能為MSSA的防控提供更準(zhǔn)確的參考依據(jù)。

綜上所述，ST7、ST188、ST59和ST398是該院臨床分離MSSA的主要MLST型別。我國MSSA菌株對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥形勢嚴(yán)峻，對SA的抗菌效果屬于大環(huán)內(nèi)酯類的“短板”，喹紅霉素與常用于抗SA的其他抗菌藥物相比并無明顯優(yōu)勢，但較經(jīng)典大環(huán)內(nèi)酯類藥物紅霉素效果已有顯著提升，故筆者相信，隨著新一代大環(huán)內(nèi)酯類藥物的不斷開發(fā)，終將能夠達(dá)到理想的效果。本研究提示，ST型別與MSSA對喹紅霉素MIC值分布之間無明顯特點(diǎn)，但由于樣本量較小，不一定具有代表性，有待更大樣本量的研究進(jìn)一步探討。