鄧一秒 楊璐環(huán) 張曉婷 董冬麗 唐書澤

（暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系 廣州 510632）

沙門氏菌（Salmonella）是一種導(dǎo)致人畜共患沙門氏菌?。⊿almonellosis）發(fā)病率高的致病菌。我國人細(xì)菌類食物中毒案例中，70%～80%是由沙門氏菌引起的，沙門氏菌中毒食品中，約90%屬于肉、蛋、奶動物產(chǎn)品[1]。探究沙門氏菌在食品生產(chǎn)加工環(huán)境下的污染途徑和生長特性，是保障食品生物性安全和降低細(xì)菌性疾病風(fēng)險的關(guān)鍵。

沙門氏菌因不產(chǎn)芽孢孢子，被認(rèn)為是一種熱敏、易被殺死的致病菌，因而，在食品加工生產(chǎn)過程中，沙門氏菌對環(huán)境的適應(yīng)和抵抗特性容易被忽視。如沙門氏菌具有血清型種類繁多[2]、革蘭氏陰性復(fù)雜細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和生物菌膜等抗逆危害等特點[3]。沙門氏菌在生物和非生物表面形成的菌膜因其孢外復(fù)雜結(jié)構(gòu)和孢內(nèi)群體感應(yīng)，大大增強了菌體對外在環(huán)境，如酸堿度、溫度、滲透壓、消毒劑、抗生素等的抵抗能力，從而引起食品安全問題[4-5]。

在食品加工過程中，乙醇常用作儀器設(shè)備表面的殺菌劑和消毒劑，低濃度的乙醇也被用作漢堡、醬油等產(chǎn)品中的防腐劑以延長產(chǎn)品貨架期，除此之外，乙醇也廣泛存在于發(fā)酵食品、飲料和果產(chǎn)品中并被認(rèn)為發(fā)揮抑菌保鮮作用[6]。Chiou等[7]研究報道，低濃度的乙醇適應(yīng)對腸炎沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌、阪崎腸桿菌不僅沒有抑制作用，相反還產(chǎn)生直接或間接的保護(hù)作用。這一研究結(jié)果目前只限于低含量的乙醇適應(yīng)對浮游菌和無機酸的影響，缺乏乙醇適應(yīng)對致病菌菌膜和有機酸影響的文獻(xiàn)報道。

本文選取發(fā)病率高的食源性致病菌鼠傷寒沙門氏菌，以5%的乙醇作乙醇適應(yīng)性試驗，探究低含量乙醇適應(yīng)對浮游菌和菌膜耐致死脅迫的影響以及乙醇作用方式對鼠傷寒沙門氏菌菌膜形成的影響，為有效防控鼠傷寒沙門氏菌及其菌膜危害風(fēng)險提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

鼠傷寒沙門氏菌 ATCC14028，廣東環(huán)凱微生物生物科技有限公司；大豆瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物生物科技有限公司。

1.2 試劑與儀器設(shè)備

結(jié)晶紫，健陽生物科技有限公司；無菌PBS，博士德生物工程有限公司；酶標(biāo)儀（Infiniti M200pro，Switzerland），帝肯貿(mào)易有限公司；偏光顯微鏡，重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；6/96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，Costar；蓋玻片（玻璃材質(zhì)，22 mm×22 mm），載玻片（玻璃材質(zhì)，25 mm×75 mm），江蘇世泰實驗器材有限公司。

1.3 菌種的培養(yǎng)與前處理

參考文獻(xiàn)[8]方法，將凍藏在-80℃的鼠傷寒沙門氏菌在TSA平板上轉(zhuǎn)接2次，挑取單菌落接種于5 mL的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，37℃以120 r/min振蕩培養(yǎng)16 h至生長穩(wěn)定期，4 500 r/min離心10 min，棄去上清液，用5 mL磷酸緩沖鹽溶液洗滌2次，重新懸于一定量的無菌磷酸鹽緩沖液中制備對數(shù)期菌懸液（約為109），渦旋振蕩均勻用于后續(xù)試驗。

1.4 鼠傷寒沙門氏菌菌膜培養(yǎng)與觀察

1.4.1 結(jié)晶紫染色觀察鼠傷寒沙門氏菌生物菌膜 在6孔平底板（放置22 mm×22 mm的蓋玻片）中加入200 μL上述菌懸液并加入5 mL TSB培養(yǎng)基，在30 ℃培養(yǎng) 0，12，24，36，48 h 后取出蓋玻片，用無菌磷酸鹽緩沖液洗去浮游菌；用250 μL的無水甲醇固定15 min，自然風(fēng)干后用0.1%的結(jié)晶紫染色5 min，用無菌磷酸鹽緩沖液洗至無紫色脫出，自然干燥，置顯微鏡下觀察，同時做空白對照[9]。

1.4.2 培養(yǎng)時間對鼠傷寒沙門氏菌生物菌膜形成的影響 將20 μL上述菌懸液與200 μL TSB加入96孔板，同時加入220 μL TSB基孔作為陰性對照，置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 0，12，24，36，48，72，96 h后，吸出培養(yǎng)液，加入 200 μL的 PBS洗滌3次以除去浮游菌，自然干燥，加入220 μL的無水甲醇固定15 min，自然風(fēng)干后，加入0.1%的結(jié)晶紫染色5 min，吸出結(jié)晶紫，用無菌磷酸鹽緩沖液洗至無色，室溫干燥后加入33%的冰醋酸處理10 min，在多功能酶標(biāo)儀570 nm處測其OD值，試驗重復(fù)3次取平均值[10]。

1.4.3 乙醇含量及作用方式對鼠傷寒沙門氏菌生物菌膜形成的影響 將20 μL菌懸液與200 μL TSB加入96孔板培養(yǎng)24 h后，吸出培養(yǎng)液，用220 μL的PBS洗滌3次除去浮游菌，干燥后加入200 μL 0%，2.5%，5%，7.5%，10% 乙 醇 含 量 的TSB，錫箔紙封住后再培養(yǎng)24 h；或?qū)?0 μL菌懸液分別與 200 μL 0%，2.5%，5%，7.5%，10%乙醇含量的TSB加入96孔板，置于30℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。同時加入220 μL TSB基孔作為陰性對照，達(dá)到時間后吸出培養(yǎng)液，加入200 μL的PBS洗滌3次以除去浮游菌后，操作過程如1.4.2節(jié)，用酶標(biāo)儀在570 nm處測其OD值，試驗重復(fù)3次取平均值。

1.5 5%乙醇適應(yīng)對鼠傷寒沙門氏菌及菌膜耐致死脅迫的影響

1.5.1 乙醇適應(yīng)處理在平板上挑取單菌落接種于5 mL的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，37℃以120 r/min振蕩培養(yǎng)16 h至生長穩(wěn)定期，4 500 r/min離心10 min，棄去上清液，用5 mL的磷酸緩沖鹽溶液洗滌2次，沉淀重懸于3.5 mL乙醇含量為5%的TSB中，渦旋振蕩均勻得到對數(shù)期菌懸液。從同一管菌懸液中分別取1 mL裝于兩管15 mL的離心管，8 000 r/min離心10 min后，沉淀分別重懸于10 mL 0%、5%乙醇含量的TSB，25℃/170 r/min孵化1 h，渦旋均勻用于后續(xù)試驗[11]。

1.5.2 菌膜形成過程中5%乙醇適應(yīng)菌對蘋果酸的耐受性在6孔平底板（放置了22 mm×22 mm 的蓋玻片）中加入200 μL乙醇適應(yīng)菌或未經(jīng)處理的菌懸液，再加入5 mL蘋果酸質(zhì)量濃度為0，0.5，1，1.5 mg/mL 的 1/10 TSB，置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，用無菌PBS緩沖液沖洗蓋玻片3次以除去浮游菌，將蓋玻片置于裝有5 mL生理鹽水和玻璃珠的離心管中渦旋1 min，取1 mL菌懸液進(jìn)行10倍稀釋。

1.5.3 5%乙醇適應(yīng)處理過的浮游菌對12%乙醇的耐受性 取0.1 mL乙醇適應(yīng)菌或未經(jīng)乙醇處理的菌懸液接種于10 mL乙醇含量為2%的TSB中，25 ℃ 170 r/min 孵化 200 min。在50，100，150，200 min處取出1 mL菌懸液進(jìn)行10倍稀釋[12]。

1.5.4 5%乙醇適應(yīng)處理過的浮游菌對5 mg/mL蘋果酸的耐受性 取0.1 mL乙醇適應(yīng)菌或未經(jīng)乙醇處理的菌懸液接種于10 mL蘋果酸質(zhì)量濃度為5 mg/mL的TSB中，25℃ 170 r/min孵化200 min。在50，100，150，200 min處取出 1 mL 菌懸液進(jìn)行10倍稀釋。

1.6 細(xì)菌平板菌落計數(shù)

為了測定鼠傷寒沙門氏菌菌落數(shù)，按照1.5.2節(jié)操作選取合適的稀釋倍數(shù)將100 μL稀釋液均勻涂布于胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h后取出進(jìn)行菌落計數(shù)，試驗重復(fù)3次取平均值。

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)偏差分析，采用Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果分析

2.1 結(jié)晶紫染色確定鼠傷寒沙門氏菌生物菌膜的形成

圖1為鼠傷寒沙門氏菌在玻璃表面分別培養(yǎng)0，12，24，36，48 h 后經(jīng)結(jié)晶紫染色處理后在偏光顯微鏡下的觀察圖。

圖1 結(jié)晶紫染色法觀察鼠傷寒沙門氏菌的生物菌膜Fig.1 Formation of S.typhimurium biofilm observed by crystal violet staining

培養(yǎng)0 h后，未見明顯紅色菌體即無生物膜形成（圖1a）；培養(yǎng)12 h時的玻璃表面已經(jīng)有少量紅色菌體，菌落數(shù)較少，呈現(xiàn)稀疏松散的結(jié)構(gòu)特征（圖1b）；培養(yǎng)24 h后，菌體明顯聚集即連接的菌體數(shù)顯著增多，膜結(jié)構(gòu)趨向緊密有序，此時菌體已經(jīng)發(fā)生可逆的粘附（圖1c）；培養(yǎng)36 h時菌體粘附范圍擴(kuò)大，細(xì)菌生物膜繼續(xù)生長，且出現(xiàn)環(huán)狀連接結(jié)構(gòu)，菌體出現(xiàn)不可逆的粘附（圖1d）；培養(yǎng)48 h后整個視野中菌體數(shù)量顯著增多，菌體也更分散（圖1e）。結(jié)晶紫染色可直觀觀察生物菌膜的形成過程，細(xì)菌從浮游菌狀態(tài)到生物菌膜形成是一個復(fù)雜但有序的過程，生物菌體數(shù)量從少到多，生物菌膜也逐漸成熟。這與李紅愛等[13]報道的單增李斯特菌生物菌膜的形成過程相一致。

2.2 培養(yǎng)時間對鼠傷寒沙門氏菌生物菌膜生物量的影響

酶標(biāo)儀在570 nm處測定不同培養(yǎng)時間的鼠傷寒沙門氏菌生物菌膜OD值，見圖2。

隨著培養(yǎng)時間的延長，鼠傷寒沙門氏菌生物菌膜的OD值逐漸增大，進(jìn)一步說明鼠傷寒沙門氏菌生物菌膜的形成是一個由少到多的過程。整個菌膜的增長過程較緩慢，在24～72 h之間生物膜增長相對較快，這與結(jié)晶紫染色法觀察到的試驗結(jié)果相一致。本研究結(jié)果表明，鼠傷寒沙門氏菌菌膜在培養(yǎng)48 h后才趨于成熟。

2.3 乙醇含量及作用方式對鼠傷寒沙門氏菌生物菌膜形成的影響

乙醇作用方式對鼠傷寒沙門氏菌菌膜形成有顯著的影響（圖3）。低含量乙醇與菌懸液同時加入培養(yǎng)48 h，由于乙醇抑制作用而限制了菌膜的形成，且隨著乙醇含量的增加，抑制作用越明顯。而培養(yǎng)24 h后再加入不同乙醇含量的TSB肉湯，5%～10%的乙醇均能促進(jìn)菌膜的形成，5%的乙醇促進(jìn)效果最為顯著，這與何守奎等人報導(dǎo)相一致。Buttke[14]等報導(dǎo)細(xì)菌暴露在低含量乙醇下膜蛋白結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生可逆變化，合成更高比例的不飽和脂肪酸脂類，從而使其呈指數(shù)級增長，而低含量的乙醇對菌膜的影響機理尚不明確。為了更有效地防控鼠傷寒沙門氏菌帶來的食品安全風(fēng)險，鼠傷寒沙門氏菌及菌膜在低含量的乙醇中的生長機制值得進(jìn)一步探究。

圖2 鼠傷寒沙門氏菌生物菌膜培養(yǎng)光密度隨時間的變化Fig.2 Changes in the optical density of S.typhimurium biofilm within 96 h

圖3 乙醇含量及作用方式對鼠傷寒沙門氏菌菌膜形成的影響Fig.3 Effect of ethanol content and activity on S.typhimurium biofilm formation

2.4 菌膜形成過程中5%乙醇適應(yīng)菌對蘋果酸的耐受性

在鼠傷寒沙門氏菌生物菌膜形成過程中，5%的乙醇適應(yīng)能增加菌體對蘋果酸的耐受性，隨著蘋果酸濃度的增加，這種耐受性顯著增強（圖4）。在營養(yǎng)條件為1/10 TSB生長時乙醇適應(yīng)菌才對蘋果酸具有耐受性，在TSB生長時乙醇適應(yīng)菌對蘋果酸無耐受性，這可能與菌體的生長狀態(tài)，營養(yǎng)環(huán)境、蘋果酸濃度等共同作用有關(guān)。

圖4 菌膜形成過程中乙醇適應(yīng)菌對蘋果酸的耐受性Fig.4 Effect of ethanol adaptation on the tolerance of malic acid in the process of S.typhimurium biofilm formation

2.5 5%乙醇適應(yīng)處理過的浮游菌對12%乙醇的耐受性

隨著時間的增加，12%乙醇含量下乙醇適應(yīng)組的菌濃度始終高于對照組，兩組菌均在100～150 min時間段衰減最快，在150 min處兩者菌濃度差值最大。孵育200 min后，適應(yīng)組和對照組的菌濃度均減少了約1 lg（CFU/mL），但適應(yīng)組的菌濃度比對照組高了約0.2 lg（CFU/mL）。這表明5%乙醇適應(yīng)能增加菌體對亞致死乙醇含量的耐受性。

圖5 5%乙醇處理的鼠傷寒沙門氏菌對12%乙醇的作用Fig.5 Effect of pre-exposure to the level of 5%ethanol on the survival of S.typhimurium in 12%ethanol

2.6 5%乙醇適應(yīng)處理過的浮游菌對蘋果酸的耐受性

在5 mg/mL蘋果酸作用下，乙醇適應(yīng)組與對照組的菌濃度隨著時間的增加而減少，經(jīng)5%乙醇處理的試驗組的菌濃度始終高于對照組（圖6），孵育200 min后對照組減少了約0.96 lg（CFU/mL），而適應(yīng)組減少了約 0.73 lg（CFU/mL），200 min后乙醇處理的適應(yīng)組菌濃度較對照組高0.27 lg（CFU/mL），說明5%的乙醇適應(yīng)處理增強了菌體對蘋果酸的耐受性。已有研究證實乙醇適應(yīng)處理能增加副溶血弧菌對醋酸和乳酸的耐受性及腸炎沙門氏菌對蘋果酸的耐受性，這與rpos和SEN1564A等酸耐受基因的上調(diào)有關(guān)，也有研究表明菌體經(jīng)過乙醇適應(yīng)后細(xì)胞脂肪酸組成和蛋白質(zhì)譜發(fā)生表型改變[15]。

圖6 5%乙醇處理的鼠傷寒沙門氏菌對蘋果酸的耐受性Fig.6 Tolerance of pre-exposure to the level of 5%ethanol on the survival of Salmonella typhimurium in malic acids

3 結(jié)論

鼠傷寒沙門氏菌能在玻璃表面形成生物菌膜，且隨著時間的延長，生物菌膜形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更為致密，生物量顯著增多。乙醇作用方式對菌膜形成有顯著影響，加入不同含量的乙醇后培養(yǎng)48 h能顯著抑制菌膜的形成，而預(yù)先培養(yǎng)24 h后再加入5%的乙醇能顯著促進(jìn)菌膜的生長。在菌膜形成過程中，營養(yǎng)條件為1/10 TSB條件下，5%乙醇適應(yīng)能增加菌體對蘋果酸的耐受性，增加浮游菌對12%的乙醇及5 mg/mL蘋果酸的耐受性。因此，在尋求抑制鼠傷寒沙門氏菌的方法時，應(yīng)特別關(guān)注乙醇和蘋果酸對鼠傷寒沙門氏菌菌體的交叉保護(hù)作用。同時，在漢堡、醬油、發(fā)酵食品、果汁飲料等生產(chǎn)過程中要注意乙醇對菌體的適應(yīng)性影響，以防出現(xiàn)鼠傷寒沙門氏菌及菌膜的乙醇適應(yīng)性生長，導(dǎo)致這類產(chǎn)品潛在食品安全風(fēng)險。