鄧一秒 楊璐環(huán) 張曉婷 董冬麗 唐書澤

（暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系 廣州 510632）

沙門氏菌（Salmonella）是一種導(dǎo)致人畜共患沙門氏菌病（Salmonellosis）發(fā)病率高的致病菌。我國(guó)人細(xì)菌類食物中毒案例中，70%～80%是由沙門氏菌引起的，沙門氏菌中毒食品中，約90%屬于肉、蛋、奶動(dòng)物產(chǎn)品[1]。探究沙門氏菌在食品生產(chǎn)加工環(huán)境下的污染途徑和生長(zhǎng)特性，是保障食品生物性安全和降低細(xì)菌性疾病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)鍵。

沙門氏菌因不產(chǎn)芽孢孢子，被認(rèn)為是一種熱敏、易被殺死的致病菌，因而，在食品加工生產(chǎn)過(guò)程中，沙門氏菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)和抵抗特性容易被忽視。如沙門氏菌具有血清型種類繁多[2]、革蘭氏陰性復(fù)雜細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和生物菌膜等抗逆危害等特點(diǎn)[3]。沙門氏菌在生物和非生物表面形成的菌膜因其孢外復(fù)雜結(jié)構(gòu)和孢內(nèi)群體感應(yīng)，大大增強(qiáng)了菌體對(duì)外在環(huán)境，如酸堿度、溫度、滲透壓、消毒劑、抗生素等的抵抗能力，從而引起食品安全問(wèn)題[4-5]。

在食品加工過(guò)程中，乙醇常用作儀器設(shè)備表面的殺菌劑和消毒劑，低濃度的乙醇也被用作漢堡、醬油等產(chǎn)品中的防腐劑以延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期，除此之外，乙醇也廣泛存在于發(fā)酵食品、飲料和果產(chǎn)品中并被認(rèn)為發(fā)揮抑菌保鮮作用[6]。Chiou等[7]研究報(bào)道，低濃度的乙醇適應(yīng)對(duì)腸炎沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌、阪崎腸桿菌不僅沒(méi)有抑制作用，相反還產(chǎn)生直接或間接的保護(hù)作用。這一研究結(jié)果目前只限于低含量的乙醇適應(yīng)對(duì)浮游菌和無(wú)機(jī)酸的影響，缺乏乙醇適應(yīng)對(duì)致病菌菌膜和有機(jī)酸影響的文獻(xiàn)報(bào)道。

本文選取發(fā)病率高的食源性致病菌鼠傷寒沙門氏菌，以5%的乙醇作乙醇適應(yīng)性試驗(yàn)，探究低含量乙醇適應(yīng)對(duì)浮游菌和菌膜耐致死脅迫的影響以及乙醇作用方式對(duì)鼠傷寒沙門氏菌菌膜形成的影響，為有效防控鼠傷寒沙門氏菌及其菌膜危害風(fēng)險(xiǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

鼠傷寒沙門氏菌 ATCC14028，廣東環(huán)凱微生物生物科技有限公司；大豆瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物生物科技有限公司。

1.2 試劑與儀器設(shè)備

結(jié)晶紫，健陽(yáng)生物科技有限公司；無(wú)菌PBS，博士德生物工程有限公司；酶標(biāo)儀（Infiniti M200pro，Switzerland），帝肯貿(mào)易有限公司；偏光顯微鏡，重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；6/96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，Costar；蓋玻片（玻璃材質(zhì)，22 mm×22 mm），載玻片（玻璃材質(zhì)，25 mm×75 mm），江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司。

1.3 菌種的培養(yǎng)與前處理

參考文獻(xiàn)[8]方法，將凍藏在-80℃的鼠傷寒沙門氏菌在TSA平板上轉(zhuǎn)接2次，挑取單菌落接種于5 mL的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，37℃以120 r/min振蕩培養(yǎng)16 h至生長(zhǎng)穩(wěn)定期，4 500 r/min離心10 min，棄去上清液，用5 mL磷酸緩沖鹽溶液洗滌2次，重新懸于一定量的無(wú)菌磷酸鹽緩沖液中制備對(duì)數(shù)期菌懸液（約為109），渦旋振蕩均勻用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 鼠傷寒沙門氏菌菌膜培養(yǎng)與觀察

1.4.1 結(jié)晶紫染色觀察鼠傷寒沙門氏菌生物菌膜 在6孔平底板（放置22 mm×22 mm的蓋玻片）中加入200 μL上述菌懸液并加入5 mL TSB培養(yǎng)基，在30 ℃培養(yǎng) 0，12，24，36，48 h 后取出蓋玻片，用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液洗去浮游菌；用250 μL的無(wú)水甲醇固定15 min，自然風(fēng)干后用0.1%的結(jié)晶紫染色5 min，用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液洗至無(wú)紫色脫出，自然干燥，置顯微鏡下觀察，同時(shí)做空白對(duì)照[9]。

1.4.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)鼠傷寒沙門氏菌生物菌膜形成的影響 將20 μL上述菌懸液與200 μL TSB加入96孔板，同時(shí)加入220 μL TSB基孔作為陰性對(duì)照，置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 0，12，24，36，48，72，96 h后，吸出培養(yǎng)液，加入 200 μL的 PBS洗滌3次以除去浮游菌，自然干燥，加入220 μL的無(wú)水甲醇固定15 min，自然風(fēng)干后，加入0.1%的結(jié)晶紫染色5 min，吸出結(jié)晶紫，用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液洗至無(wú)色，室溫干燥后加入33%的冰醋酸處理10 min，在多功能酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)其OD值，試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值[10]。

1.4.3 乙醇含量及作用方式對(duì)鼠傷寒沙門氏菌生物菌膜形成的影響 將20 μL菌懸液與200 μL TSB加入96孔板培養(yǎng)24 h后，吸出培養(yǎng)液，用220 μL的PBS洗滌3次除去浮游菌，干燥后加入200 μL 0%，2.5%，5%，7.5%，10% 乙 醇 含 量 的TSB，錫箔紙封住后再培養(yǎng)24 h；或?qū)?0 μL菌懸液分別與 200 μL 0%，2.5%，5%，7.5%，10%乙醇含量的TSB加入96孔板，置于30℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。同時(shí)加入220 μL TSB基孔作為陰性對(duì)照，達(dá)到時(shí)間后吸出培養(yǎng)液，加入200 μL的PBS洗滌3次以除去浮游菌后，操作過(guò)程如1.4.2節(jié)，用酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)其OD值，試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.5 5%乙醇適應(yīng)對(duì)鼠傷寒沙門氏菌及菌膜耐致死脅迫的影響

1.5.1 乙醇適應(yīng)處理在平板上挑取單菌落接種于5 mL的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，37℃以120 r/min振蕩培養(yǎng)16 h至生長(zhǎng)穩(wěn)定期，4 500 r/min離心10 min，棄去上清液，用5 mL的磷酸緩沖鹽溶液洗滌2次，沉淀重懸于3.5 mL乙醇含量為5%的TSB中，渦旋振蕩均勻得到對(duì)數(shù)期菌懸液。從同一管菌懸液中分別取1 mL裝于兩管15 mL的離心管，8 000 r/min離心10 min后，沉淀分別重懸于10 mL 0%、5%乙醇含量的TSB，25℃/170 r/min孵化1 h，渦旋均勻用于后續(xù)試驗(yàn)[11]。

1.5.2 菌膜形成過(guò)程中5%乙醇適應(yīng)菌對(duì)蘋果酸的耐受性在6孔平底板（放置了22 mm×22 mm 的蓋玻片）中加入200 μL乙醇適應(yīng)菌或未經(jīng)處理的菌懸液，再加入5 mL蘋果酸質(zhì)量濃度為0，0.5，1，1.5 mg/mL 的 1/10 TSB，置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，用無(wú)菌PBS緩沖液沖洗蓋玻片3次以除去浮游菌，將蓋玻片置于裝有5 mL生理鹽水和玻璃珠的離心管中渦旋1 min，取1 mL菌懸液進(jìn)行10倍稀釋。

1.5.3 5%乙醇適應(yīng)處理過(guò)的浮游菌對(duì)12%乙醇的耐受性 取0.1 mL乙醇適應(yīng)菌或未經(jīng)乙醇處理的菌懸液接種于10 mL乙醇含量為2%的TSB中，25 ℃ 170 r/min 孵化 200 min。在50，100，150，200 min處取出1 mL菌懸液進(jìn)行10倍稀釋[12]。

1.5.4 5%乙醇適應(yīng)處理過(guò)的浮游菌對(duì)5 mg/mL蘋果酸的耐受性 取0.1 mL乙醇適應(yīng)菌或未經(jīng)乙醇處理的菌懸液接種于10 mL蘋果酸質(zhì)量濃度為5 mg/mL的TSB中，25℃ 170 r/min孵化200 min。在50，100，150，200 min處取出 1 mL 菌懸液進(jìn)行10倍稀釋。

1.6 細(xì)菌平板菌落計(jì)數(shù)

為了測(cè)定鼠傷寒沙門氏菌菌落數(shù)，按照1.5.2節(jié)操作選取合適的稀釋倍數(shù)將100 μL稀釋液均勻涂布于胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h后取出進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)偏差分析，采用Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果分析

2.1 結(jié)晶紫染色確定鼠傷寒沙門氏菌生物菌膜的形成

圖1為鼠傷寒沙門氏菌在玻璃表面分別培養(yǎng)0，12，24，36，48 h 后經(jīng)結(jié)晶紫染色處理后在偏光顯微鏡下的觀察圖。

圖1 結(jié)晶紫染色法觀察鼠傷寒沙門氏菌的生物菌膜Fig.1 Formation of S.typhimurium biofilm observed by crystal violet staining

培養(yǎng)0 h后，未見(jiàn)明顯紅色菌體即無(wú)生物膜形成（圖1a）；培養(yǎng)12 h時(shí)的玻璃表面已經(jīng)有少量紅色菌體，菌落數(shù)較少，呈現(xiàn)稀疏松散的結(jié)構(gòu)特征（圖1b）；培養(yǎng)24 h后，菌體明顯聚集即連接的菌體數(shù)顯著增多，膜結(jié)構(gòu)趨向緊密有序，此時(shí)菌體已經(jīng)發(fā)生可逆的粘附（圖1c）；培養(yǎng)36 h時(shí)菌體粘附范圍擴(kuò)大，細(xì)菌生物膜繼續(xù)生長(zhǎng)，且出現(xiàn)環(huán)狀連接結(jié)構(gòu)，菌體出現(xiàn)不可逆的粘附（圖1d）；培養(yǎng)48 h后整個(gè)視野中菌體數(shù)量顯著增多，菌體也更分散（圖1e）。結(jié)晶紫染色可直觀觀察生物菌膜的形成過(guò)程，細(xì)菌從浮游菌狀態(tài)到生物菌膜形成是一個(gè)復(fù)雜但有序的過(guò)程，生物菌體數(shù)量從少到多，生物菌膜也逐漸成熟。這與李紅愛(ài)等[13]報(bào)道的單增李斯特菌生物菌膜的形成過(guò)程相一致。

2.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)鼠傷寒沙門氏菌生物菌膜生物量的影響

酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間的鼠傷寒沙門氏菌生物菌膜OD值，見(jiàn)圖2。

隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，鼠傷寒沙門氏菌生物菌膜的OD值逐漸增大，進(jìn)一步說(shuō)明鼠傷寒沙門氏菌生物菌膜的形成是一個(gè)由少到多的過(guò)程。整個(gè)菌膜的增長(zhǎng)過(guò)程較緩慢，在24～72 h之間生物膜增長(zhǎng)相對(duì)較快，這與結(jié)晶紫染色法觀察到的試驗(yàn)結(jié)果相一致。本研究結(jié)果表明，鼠傷寒沙門氏菌菌膜在培養(yǎng)48 h后才趨于成熟。

2.3 乙醇含量及作用方式對(duì)鼠傷寒沙門氏菌生物菌膜形成的影響

乙醇作用方式對(duì)鼠傷寒沙門氏菌菌膜形成有顯著的影響（圖3）。低含量乙醇與菌懸液同時(shí)加入培養(yǎng)48 h，由于乙醇抑制作用而限制了菌膜的形成，且隨著乙醇含量的增加，抑制作用越明顯。而培養(yǎng)24 h后再加入不同乙醇含量的TSB肉湯，5%～10%的乙醇均能促進(jìn)菌膜的形成，5%的乙醇促進(jìn)效果最為顯著，這與何守奎等人報(bào)導(dǎo)相一致。Buttke[14]等報(bào)導(dǎo)細(xì)菌暴露在低含量乙醇下膜蛋白結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生可逆變化，合成更高比例的不飽和脂肪酸脂類，從而使其呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，而低含量的乙醇對(duì)菌膜的影響機(jī)理尚不明確。為了更有效地防控鼠傷寒沙門氏菌帶來(lái)的食品安全風(fēng)險(xiǎn)，鼠傷寒沙門氏菌及菌膜在低含量的乙醇中的生長(zhǎng)機(jī)制值得進(jìn)一步探究。

圖2 鼠傷寒沙門氏菌生物菌膜培養(yǎng)光密度隨時(shí)間的變化Fig.2 Changes in the optical density of S.typhimurium biofilm within 96 h

圖3 乙醇含量及作用方式對(duì)鼠傷寒沙門氏菌菌膜形成的影響Fig.3 Effect of ethanol content and activity on S.typhimurium biofilm formation

2.4 菌膜形成過(guò)程中5%乙醇適應(yīng)菌對(duì)蘋果酸的耐受性

在鼠傷寒沙門氏菌生物菌膜形成過(guò)程中，5%的乙醇適應(yīng)能增加菌體對(duì)蘋果酸的耐受性，隨著蘋果酸濃度的增加，這種耐受性顯著增強(qiáng)（圖4）。在營(yíng)養(yǎng)條件為1/10 TSB生長(zhǎng)時(shí)乙醇適應(yīng)菌才對(duì)蘋果酸具有耐受性，在TSB生長(zhǎng)時(shí)乙醇適應(yīng)菌對(duì)蘋果酸無(wú)耐受性，這可能與菌體的生長(zhǎng)狀態(tài)，營(yíng)養(yǎng)環(huán)境、蘋果酸濃度等共同作用有關(guān)。

圖4 菌膜形成過(guò)程中乙醇適應(yīng)菌對(duì)蘋果酸的耐受性Fig.4 Effect of ethanol adaptation on the tolerance of malic acid in the process of S.typhimurium biofilm formation

2.5 5%乙醇適應(yīng)處理過(guò)的浮游菌對(duì)12%乙醇的耐受性

隨著時(shí)間的增加，12%乙醇含量下乙醇適應(yīng)組的菌濃度始終高于對(duì)照組，兩組菌均在100～150 min時(shí)間段衰減最快，在150 min處兩者菌濃度差值最大。孵育200 min后，適應(yīng)組和對(duì)照組的菌濃度均減少了約1 lg（CFU/mL），但適應(yīng)組的菌濃度比對(duì)照組高了約0.2 lg（CFU/mL）。這表明5%乙醇適應(yīng)能增加菌體對(duì)亞致死乙醇含量的耐受性。

圖5 5%乙醇處理的鼠傷寒沙門氏菌對(duì)12%乙醇的作用Fig.5 Effect of pre-exposure to the level of 5%ethanol on the survival of S.typhimurium in 12%ethanol

2.6 5%乙醇適應(yīng)處理過(guò)的浮游菌對(duì)蘋果酸的耐受性

在5 mg/mL蘋果酸作用下，乙醇適應(yīng)組與對(duì)照組的菌濃度隨著時(shí)間的增加而減少，經(jīng)5%乙醇處理的試驗(yàn)組的菌濃度始終高于對(duì)照組（圖6），孵育200 min后對(duì)照組減少了約0.96 lg（CFU/mL），而適應(yīng)組減少了約 0.73 lg（CFU/mL），200 min后乙醇處理的適應(yīng)組菌濃度較對(duì)照組高0.27 lg（CFU/mL），說(shuō)明5%的乙醇適應(yīng)處理增強(qiáng)了菌體對(duì)蘋果酸的耐受性。已有研究證實(shí)乙醇適應(yīng)處理能增加副溶血弧菌對(duì)醋酸和乳酸的耐受性及腸炎沙門氏菌對(duì)蘋果酸的耐受性，這與rpos和SEN1564A等酸耐受基因的上調(diào)有關(guān)，也有研究表明菌體經(jīng)過(guò)乙醇適應(yīng)后細(xì)胞脂肪酸組成和蛋白質(zhì)譜發(fā)生表型改變[15]。

圖6 5%乙醇處理的鼠傷寒沙門氏菌對(duì)蘋果酸的耐受性Fig.6 Tolerance of pre-exposure to the level of 5%ethanol on the survival of Salmonella typhimurium in malic acids

3 結(jié)論

鼠傷寒沙門氏菌能在玻璃表面形成生物菌膜，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，生物菌膜形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更為致密，生物量顯著增多。乙醇作用方式對(duì)菌膜形成有顯著影響，加入不同含量的乙醇后培養(yǎng)48 h能顯著抑制菌膜的形成，而預(yù)先培養(yǎng)24 h后再加入5%的乙醇能顯著促進(jìn)菌膜的生長(zhǎng)。在菌膜形成過(guò)程中，營(yíng)養(yǎng)條件為1/10 TSB條件下，5%乙醇適應(yīng)能增加菌體對(duì)蘋果酸的耐受性，增加浮游菌對(duì)12%的乙醇及5 mg/mL蘋果酸的耐受性。因此，在尋求抑制鼠傷寒沙門氏菌的方法時(shí)，應(yīng)特別關(guān)注乙醇和蘋果酸對(duì)鼠傷寒沙門氏菌菌體的交叉保護(hù)作用。同時(shí)，在漢堡、醬油、發(fā)酵食品、果汁飲料等生產(chǎn)過(guò)程中要注意乙醇對(duì)菌體的適應(yīng)性影響，以防出現(xiàn)鼠傷寒沙門氏菌及菌膜的乙醇適應(yīng)性生長(zhǎng)，導(dǎo)致這類產(chǎn)品潛在食品安全風(fēng)險(xiǎn)。