熊石龍,吳一行,龔芳,何偉
隨著人們生活水平的提高以及生活模式“西方化”、社會人口老齡化,我國糖尿病患病人數(shù)逐年增高。糖尿病是一種全身性代謝紊亂性疾病,不僅會影響糖類的代謝,導致高血糖、血糖波動,還會影響蛋白質(zhì)和脂質(zhì)代謝,導致脂代謝紊亂和高脂血癥,從而造成血管壁炎性損傷、狹窄。相關(guān)研究表明,炎癥和免疫反應可能與2 型糖尿?。═2DM)及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1]。
組織因子(tissue factor,TF),又稱組織凝血活酶(Thromboplastin),在糖尿病患者中表達明顯增高,是血管內(nèi)皮損傷的重要標志,也是外源性凝血途徑的啟動因子和重要的炎癥因子[2]。新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子α 誘導蛋白8 樣分子2(tumor necrosis factor-α induced protein 8 like-2,TIPE2)屬于腫瘤壞死因子α 誘導蛋白8(tumor necrosis factor-α induced protein-8,TNFAIP8)家族,優(yōu)先表達在淋巴組織和炎癥組織中,是一種炎癥負性調(diào)節(jié)因子,在保持免疫平衡中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[3]。但免疫調(diào)節(jié)因子TIPE2與炎癥因子TF在T2DM血管病變患者中的作用及其關(guān)系尚不明確。本研究旨在探討T2DM 血管病變患者外周血單個核細胞(PBMCs)中TIPE2與TF的變化,了解TIPE2、TF及腫瘤壞死因子(TNF)-α 對T2DM 血管病變患者的臨床意義,為進一步對T2DM 血管并發(fā)癥的臨床有效干預提供依據(jù)。
1.1 研究對象 選擇廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院番禺院區(qū)2015年5月—2016年5月收集的T2DM患者78例,其中男54例,女24例。所有患者診斷均符合2013版中國T2DM防治指南中的診斷標準[4]?;颊咭罁?jù)是否合并有血管病變,分為血管病變(T2DM+V)組36 例和非血管病變組(T2DM)組42 例,T2DM+V 組患者均合并微血管及大血管病變,T2DM 組均未合并微血管及大血管病變。排除1型糖尿?。═1DM)及繼發(fā)性糖尿病者;患急性感染性疾病者;合并高血壓腎病、慢性腎小球腎炎、尿毒癥或透析患者;合并風濕性疾病或其他內(nèi)分泌代謝疾病者;合并心腦血管疾病、肝腎功能不全、血液系統(tǒng)疾病、腫瘤、感染者;長期服用避孕藥者;妊娠、哺乳期女性。另選取同期在我院體檢正常者40例為對照(CON)組,均排除糖尿病及內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病,空腹糖耐量正常,無感染、心、肝、肺、腎等疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會論證通過,患者及家屬簽署知情同意書。
1.2 主要試劑及儀器 糖化血紅蛋白(HbA1c)分析儀(東曹上海生物科技有限公司,HLC-723G8),貝克曼全自動生物化學分析儀(美國貝克曼庫爾特有限公司,DXC600),實時熒光定量PCR 儀(美國應用生物系統(tǒng)公司,7500fast),酶標儀(美國伯騰儀器有限公司,Synergy HT)。HbA1c檢測試劑盒購自廣州惠堯生物科技有限公司;總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)檢測試劑盒均購自德國德賽診斷系統(tǒng)有限公司;Ficoll 淋巴細胞分離液購自美國GE 醫(yī)療集團;Trizol 試劑及RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自美國Invitrogen 公司,實時熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。引物購自上海吉凱生物技術(shù)有限責任公司。血漿TF 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒購自美國ADI公司,血漿TNF-α ELISA試劑盒購自美國R & D公司。
1.3 方法
1.3.1 臨床資料收集 收集并記錄研究對象年齡、性別、血清HbA1c、TC、TG、HDL-C、LDL-C水平。高效液相色譜法檢測HbA1c;酶比色法檢測TC 和TG;修飾酶法檢測HDL-C 和LDL-C。
1.3.2 PBMCs 分離 清晨采集空腹血樣3 mL,加入Ficoll 淋巴細胞分離液,密度梯度離心法進行分離,取中間白膜層,即PBMCs。
1.3.3 實時熒光定量PCR檢測PBMCs中TIPE2、TF mRNA表達 利用Trizol 試劑從新鮮的PBMCs 中提取總RNA,一步法逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 后使用SYBR Green 染料法進行實時熒光定量PCR,按照說明書步驟檢測TIPE2、TF 的mRNA 表達。引物序列:TIPE2,上游5′-TGTGCTGCTAGAGTTGGTGGA-3′,下游5′-TGCCAAGGTGCTGAGTGAA-3′;TF,上游5′-CCCAAACCCGTCAATCAAGTC-3′,下游5′-CCAAGTACGTCTGCTTCACAT-3′ ;β - actin,上游 5′- GGTGGTCTACCCTTGGACCC-3′ ,下 游 5′- GATACTTGTGGGCCAGGGCA-3′。兩步法PCR 擴增條件:95 ℃30 s;95 ℃3 s,60 ℃30 s,40 個循環(huán)??偡磻w積20 μL。根據(jù)qPCR 得出的熒光曲線Ct 值,以β-actin 為內(nèi)參,用2-ΔΔCt法統(tǒng)計結(jié)果,ΔCt=目的基因Ct 值-內(nèi)參Ct 值,ΔΔCt=實驗組ΔCt 值-對照組ΔCt值。實驗重復3次。
1.3.4 ELISA 檢測血漿TF和TNF-α水平 采集清晨空腹外周血,靜置30 min 后,3 000 r/min 離心10 min,將血漿分裝凍存于-80 ℃冰箱備用,集中測量。嚴格按照說明書進行檢測,使用酶標儀在450 nm波長處測定標準品和樣品光密度(OD)值,并根據(jù)標準曲線計算TF及TNF-α濃度,每個樣品設3個復孔。
1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料應用例(%)表示,多組之間比較應用χ2檢驗。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,組間多重比較采用LSD-t檢驗,指標間關(guān)系測定采用Pearson線性相關(guān)分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 3組一般臨床資料比較 3組性別、年齡、血脂方面的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與CON 組相比,T2DM 組和T2DM+V 組HbA1c 升高,且T2DM+V組高于T2DM組(P<0.05),見表1。
Tab.1 Comparison of general clinical data between three groups表1 3組一般臨床資料比較
2.2 3組PBMCs 中TIPE2、TF mRNA 表達情況 與CON 組比較,T2DM 組TIPE2 mRNA 表達水平降低,T2DM+V 組較T2DM 組更低(均P<0.05)。T2DM 組TF mRNA 表達水平高于CON 組,T2DM+V 組高于T2DM組(均P<0.05),見表2。
Tab.2 Comparison of TIPE2 mRNA and TF mRNA of PBMCs between three groups表2 3組PBMCs中TIPE2、TF mRNA表達水平的比較(±s)
Tab.2 Comparison of TIPE2 mRNA and TF mRNA of PBMCs between three groups表2 3組PBMCs中TIPE2、TF mRNA表達水平的比較(±s)
**P<0.01;a與CON組比較,b與T2DM組比較,P<0.05
組別CON組T2DM組T2DM+V組F n 40 42 36 TIPE2 mRNA 1.04±0.06 0.33±0.07a 0.13±0.04ab 2 364.317**TF mRNA 1.04±0.06 3.42±0.47a 5.85±0.78ab 820.459**
2.3 3組血漿中TF、TNF-α濃度比較 與CON組相比,T2DM 組TF、TNF-α 濃度明顯升高,T2DM+V 組較T2DM 組TF、TNF-α 濃度升高更明顯(均P<0.05),見表3。
Tab.3 Comparison of plasma levels of TF and TNF-α between three groups表3 3組血漿中TF、TNF-α濃度的比較 (ng/L,±s)
Tab.3 Comparison of plasma levels of TF and TNF-α between three groups表3 3組血漿中TF、TNF-α濃度的比較 (ng/L,±s)
**P<0.01;a與CON組比較,b與T2DM組比較,P<0.05
組別nTFTNF-α CON組T2DM組T2DM+V組F 40 42 36 21.63±2.66 32.21±2.48a 38.39±3.89ab 299.337**20.13±2.04 29.79±2.16a 39.27±4.96ab 329.118**
2.4 3組間各指標相關(guān)性分析 CON 組及T2DM 組內(nèi)各指標間無相關(guān)性。T2DM+V 組PBMCs 中TF mRNA 與TIPE2 mRNA 呈負相關(guān)(r=-0.340,P<0.05),血漿TF與血漿TNF-α呈正相關(guān)(r=0.724,P<0.001)。3組PBMCs 中TIPE2 mRNA 表達與TF mRNA 及血漿TF、TNF-α 濃度的相關(guān)性分析結(jié)果顯示,T2DM+V 組中TIPE2 mRNA 表達水平與TF mRNA及血漿TNF-α均呈負相關(guān),見表4。
Tab.4 Correlation between TIPE2 mRNA and TF mRNA,plasma levels of TF and TNF-α in three groups表4 3組TIPE2 mRNA表達水平與TF mRNA表達水平及血漿TF、TNF-α濃度的相關(guān)性分析(r)
隨著胰島素、口服降糖藥物的廣泛應用,高血糖及急性合并癥,如酮癥酸中毒導致的死亡人數(shù)己顯著下降,目前各種急慢性并發(fā)癥已成為嚴重影響糖尿病患者生存質(zhì)量的主要原因,其中糖尿病血管病變是最常見的也是患者致死、致殘的最主要的原因之一。T2DM 血管病變主要包括大血管病變和微血管病變,并發(fā)大血管病變多見于主動脈、腦動脈及冠狀動脈,極易引起嚴重的心、腦血管意外;微血管病變主要表現(xiàn)為糖尿病腎病、視網(wǎng)膜病變和糖尿病心肌病,嚴重影響患者的生活質(zhì)量[5]。
3.1 血管內(nèi)皮細胞損傷是糖尿病血管病變的根本原因 高血糖引起超氧化物生成增多,繼而引起氧化應激及生成的糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)被公認為是導致血管內(nèi)皮功能損傷的兩個重要環(huán)節(jié)[6],高血糖還可誘導內(nèi)皮細胞炎癥、凋亡,從而造成血管壁的結(jié)構(gòu)改變和血管內(nèi)皮功能損傷[7]。此外,T2DM患者體內(nèi)普遍存在微炎癥狀態(tài)。微炎癥狀態(tài)是指既非微生物感染,又不同于全身炎癥反應綜合征的慢性、進展性、低強度性、相對隱匿性的炎癥狀態(tài),其特征是單核巨噬細胞系統(tǒng)激活,產(chǎn)生TNF-α和白細胞介素(IL)-6等炎癥因子,進而參與T2DM 及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[8]。TNF-α可抑制血管內(nèi)皮細胞一氧化氮合成酶(NOS)表達與活性,降低內(nèi)皮細胞胰島素受體表達及磷酸化,抑制胰島素信號轉(zhuǎn)導,導致內(nèi)皮依賴性血管舒張功能受損,并促進多種因子及細胞黏附分子的表達,最終引發(fā)內(nèi)皮細胞功能異常甚至凋亡。本研究結(jié)果表明,T2DM+V 組血漿TF 和TNF-α 水平高于T2DM組和CON 組,相關(guān)性分析表明TF 與TNF-α 呈正相關(guān),提示炎癥因子TF、TNF-α在T2DM血管病變的發(fā)生發(fā)展中起協(xié)同促進作用。
3.2 血管內(nèi)皮細胞損傷可誘導炎癥因子TF 表達 病理情況下,TF過度表達及活性異常升高將導致動、靜脈血栓形成。在動脈粥樣硬化過程中,粥樣斑塊中的巨噬細胞表達大量TF,高水平TF 暴露引發(fā)血栓形成和心肌梗死。除誘導生理性凝血和病理性血栓形成外,TF本身還可以作為一種炎癥因子參與炎癥反應,抑制TF 表達可減輕內(nèi)毒素誘導的凝血、炎癥反應和小鼠的死亡率[9]。TF是損傷-炎癥-凝血網(wǎng)絡關(guān)鍵分子,在凝血與炎癥反應中起重要作用[10]。因此,有效抑制TF 表達具有重要的臨床意義。
3.3 TIPE2是先天性免疫及獲得性免疫的負性調(diào)節(jié)者 TIPE2 通常表達在髓系和淋巴系的免疫細胞中,特別是在T淋巴細胞、單核細胞或巨噬細胞中高表達,是調(diào)節(jié)炎癥反應以及維持免疫平衡的重要負性調(diào)節(jié)因子。TIPE2敲除的小鼠可出現(xiàn)慢性炎癥反應,表現(xiàn)為體質(zhì)量下降、脾腫大、白細胞增高以及多器官自發(fā)性炎癥反應,內(nèi)毒素刺激后則出現(xiàn)過度應答以致發(fā)生膿毒癥,甚至死亡[3]。臨床研究發(fā)現(xiàn),系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者PBMCs 中TIPE2 mRNA 表達水平較健康對照者明顯降低,且與SLE 患者的疾病活動度評分呈負相關(guān)[11]。Ma等[12]研究發(fā)現(xiàn),在哮喘患兒PBMCs 中TIPE2 mRNA 表達水平明顯下降。此外,慢性HBV感染肝炎患者PBMCs 中TIPE2的表達水平也明顯下降,且TIPE2 水平與血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽紅素(TBIL)水平呈負相關(guān)[13]。本課題組前期研究也表明,增強臍靜脈血管內(nèi)皮細胞TIPE2 表達可有效下調(diào)TF 的表達[14],但在PBMCs 中TIPE2 與TF 的關(guān)系鮮見報道。本研究發(fā)現(xiàn),T2DM+V 組患者PBMCs 中TIPE2表達下調(diào),而TF表達上調(diào),與單純T2DM組和CON 組比較差異有統(tǒng)計學意義;外周血中炎癥因子TF、TNF-α則高于其他2組,且T2DM+V 組TIPE2表達與TF mRNA、TNF-α呈負相關(guān),提示TIPE2下調(diào)可活化下游信號傳導,合成釋放炎癥因子TF、TNF-α,觸發(fā)炎癥級聯(lián)反應,加重炎癥程度,惡化細胞生存環(huán)境,引發(fā)血管內(nèi)皮損傷、功能障礙和機體血糖進一步升高,最終導致糖尿病血管病變的發(fā)生。
3.4 不足與展望 由于研究病例數(shù)較少,且具有一定地域特點,在一定程度上限制了研究結(jié)果的涵蓋性和代表性,下一步需要多中心協(xié)作、大樣本的臨床研究來進一步驗證。
綜上所述,T2DM 患者PBMCs 中TIPE2 與TF 的表達密切相關(guān),TIPE2、TF可能通過炎癥機制參與糖尿病血管病變的發(fā)生發(fā)展,有效提高TIPE2、抑制TF可為T2DM的分子治療提供新的思路。