施瑩，楊子聰，劉海潤，薛焱，張舒，黃信順，盧建勇，劉伶

隨著社會老齡化的發(fā)展，冠心病和認知功能障礙已經(jīng)成為威脅人類生活質(zhì)量的重大慢性疾病。近年來研究發(fā)現(xiàn)，冠心病患者發(fā)生認知功能障礙的風(fēng)險較普通人群顯著增加，并且兩者之間具有許多相同的危險因素，如肥胖、高齡、高血壓病史、糖尿病、吸煙史及飲酒史等［1］。除此之外，炎癥反應(yīng)及血管損傷也被發(fā)現(xiàn)在冠心病及認知功能障礙的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用［2-5］，遺傳因素如相關(guān)炎性因子的基因多態(tài)性與二者的發(fā)病風(fēng)險密切相關(guān)［6-7］。白細胞介素（Interleukin，IL）-35 是1997 年由Devergne等［8］發(fā)現(xiàn)，是由EBi3及IL-12A（IL-12p35）兩個亞基構(gòu)成的一種異二聚體，分子結(jié)構(gòu)與其他IL-12 家族細胞因子相似。2002 年，IL-35 被正式定義為一種新的抗炎因子［9］。近年來多項研究發(fā)現(xiàn)，IL-35在包括心腦血管疾病在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用［10-11］。本課題組前期研究及一項針對墨西哥人群的研究均發(fā)現(xiàn)IL-35基因位點多態(tài)性可能與冠心病的發(fā)病風(fēng)險存在相關(guān)性［12-13］。但目前關(guān)于IL-35 基因多態(tài)性與疾病易感性的研究尚少見，尤其是針對IL-35 基因多態(tài)性與認知功能障礙的相關(guān)性研究更為少見。本研究擬對IL-35基因多態(tài)性與冠心病患者認知功能障礙的發(fā)生風(fēng)險進行探討。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2015年2月—2016年10月在廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科住院的冠心病患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：首次經(jīng)冠狀動脈造影或典型臨床癥狀及（或）心電圖、心肌損傷標(biāo)志物診斷為冠心?。ò毙孕募」Ｋ溃┑幕颊撸?4-15］。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有其他嚴重疾病如惡性腫瘤、嚴重肝臟疾病、自身免疫性疾病等。（2）有腦實質(zhì)、血管疾病史（如腦出血、腦梗死、腦外傷）及其他中樞性神經(jīng)疾病病史（如癲癇、帕金森癥）等。（3）有視、聽功能障礙或意識障礙不能配合完成認知功能評估者。（4）其他情況不能配合完成認知功能評估者。符合以上標(biāo)準(zhǔn)者共406例，同意參加本項研究者349（86.0%）例，其中男240 例，女109 例，年齡29～78 歲，平均（60.15±7.55）歲。本研究獲得廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 基線資料收集 所有研究對象在入院24 h內(nèi)，由經(jīng)過培訓(xùn)的研究人員進行基本資料采集，并進行質(zhì)量控制。包括既往疾病史（如高血壓、糖尿病、房顫、腦血管疾病、中樞神經(jīng)病史等）、吸煙史、飲酒史、認知功能障礙家族史、特殊用藥史、身高、體質(zhì)量、教育水平等；其中吸煙史根據(jù)世界衛(wèi)生組織關(guān)于吸煙的定義，連續(xù)或累計吸煙6個月或以上者定義為有吸煙史者；飲酒史定義為每周飲酒至少2次，連續(xù)飲酒1年以上；教育水平：未接受正規(guī)教育者為文盲、接受小學(xué)教育者為小學(xué)，完成小學(xué)教育，接受中學(xué)教育及以上教育者為中學(xué)及以上。

1.2.2 認知功能評估 所有研究對象在入院24 h內(nèi)，由廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院認知睡眠中心精神病學(xué)副主任醫(yī)師及經(jīng)過培訓(xùn)的研究人員使用簡易精神狀態(tài)檢查量表（minimental state examination，MMSE）進行認知功能評估，并進行質(zhì)量控制。MMSE量表共包含19個項目，總分為30分，主要對研究對象的定向、記憶、語言、計算和注意力等功能進行評定，根據(jù)國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)，因教育程度不同，文盲組總分17分以下，小學(xué)組總分20 分以下，中學(xué)或以上組總分24 分以下者定義為認知功能損傷［16］。根據(jù)評估結(jié)果將患者分為認知功能正常組（對照組）205例和認知功能損傷組（病例組）144例。

1.2.3 臨床生化指標(biāo)檢測 所有研究對象于入院次日清晨空腹采血，標(biāo)本送廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院檢驗科按臨床標(biāo)準(zhǔn)流程進行檢測，使用葡萄糖氧化酶法檢測空腹血糖（fast blood glucose，F(xiàn)BG）；酶法檢測低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）；干化學(xué)層析法測C-反應(yīng)蛋白（C-reaction protein，CRP）；乳酸脫氫酶法測丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）；酶法測天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）；尿酸氧化酶法測尿酸（uric acid，UA）；酶法檢測肌酐（creatinine，Crea）等，使用改良MDRD 公式：170×（Scr）-1.234×（年齡）-0.179×（0.79 女性）計算腎小球濾過率（eGFR）。根據(jù)ELISA 試劑盒（LifeSpan Biosciences Inc.，Seattle，Washington，USA）說明書操作流程檢測血漿IL-35水平，檢測有效范圍為15.63～1 000 ng/L。

所有研究對象在入院48 h 內(nèi)行心臟彩超檢查，使用 Simpson 法對左室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、短軸縮短率（fractional shortening，F(xiàn)S）等指標(biāo)進行測量。

1.2.4 DNA 提取 所有研究對象均于入院次日清晨空腹采血5 mL，使用EDTA 抗凝，離心機分離全血后將血漿及濃縮全血細胞分別置于-80 ℃冰箱保存。嚴格按照使用說明書提取DNA（Gentrasystems，Inc.，Minneapolis，MN，USA）。

1.2.5 IL-35 基因多態(tài)性位點選擇 基于Hapmap、NCBISNP 及Genomes 數(shù)據(jù)庫進行研究位點選擇，包括：（1）最小等位基因頻率（Miner Allele Frequency，MAF）≥0.1 且r2≥0.8，選取TagSNP 基因位點。（2）優(yōu)先選取5′UTR、3′UTR、啟動子（5′near gene）、外顯子等功能區(qū)單核苷酸多態(tài)性（SNPs）位點及參考文獻［7］中報道的疾病易感性為陽性的位點進行研究。（3）根據(jù)連鎖不平衡（Linkage disequilibrium，LD）分析結(jié)果，對完全連鎖位點（r2=1）進行篩選。根據(jù)以上原則，選擇rs582054、rs2243115、rs428253、rs583911、rs568408 及rs4740進行研究。

1.2.6 基因分型 使用Sequenom Mass Array 系統(tǒng)對所研究SNP位點進行基因分型。各位點引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系：PCR 反應(yīng)緩沖液（5 mmol/L MgCl20.325 μL、15 mmol/L MgCl20.625 μL、25 mmol/L dNTP 0.100 μL），二次蒸餾去離子純凈水1.850 μL，500 nmol/L 引物混合物1.000 μL，5 U/μL HotStarTaq 0.100 μL，DNA樣本1 μL。PCR擴增程序：94 ℃5 min；94 ℃20 s，56 ℃30 s，72 ℃1 min，45 個循環(huán)；72 ℃3 min，4 ℃至終止。然后加入SAP Mix反應(yīng)液，繼續(xù)40個循環(huán)：94 ℃30 s；94 ℃5 s，52 ℃5 s，80 ℃5 s；72 ℃3 min，4 ℃至終止，使用MALDI-TOF質(zhì)譜儀分析樹脂純化后的反應(yīng)產(chǎn)物。

Tab.1 Primers for PCR表1 PCR引物列表

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用K-S檢驗對連續(xù)型變量進行正態(tài)性分布檢驗，符合正態(tài)分布的連續(xù)型變量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；不符合正態(tài)分布的連續(xù)型變量以M（P25，P75）表示，組間比較采用H檢驗或Mann-WhitneyU檢驗。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。Hardy-Weinberg 平衡定律檢驗各組樣本代表性。影響因素分析采用二元Logistic 回歸分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組患者基本臨床資料比較 病例組年齡、FBG 和ALT 均明顯高于對照組（P＜0.05）；2組間性別比例、吸煙史、飲酒史、房顫史、認知功能家族史、教育水平、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、TC、TG、LDL-C、CRP、eGFR、血漿IL-35 水平差異均無明顯統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

Tab.2 Comparison of the general clinical characteristic between the two groups表2 2組患者基本臨床資料比較

2.2 2組基因分型結(jié)果 各位點基因分型檢出率分別為：對照組rs428253（93.7%）、rs4740（95.6%）、rs2243115（98.5%）、rs568408（95.6%）、rs582054（98.5%）及rs583911（97.1%）；病例組rs428253（94.4%）、rs4740（97.9%）、rs2243115（99.3%）、rs568408（97.9%）、rs582054（98.6%）及rs583911（98.6%）。 2組 rs428253、rs4740、rs2243115、rs568408、rs582054及rs583911符合Hardy-Weinberg平衡定律（P＞0.05），病例組和對照組樣本均具有群體代表性，見表3。

2.3 冠心病患者IL-35基因位點多態(tài)性與認知功能障礙的相關(guān)性 以是否認知功能障礙（否=0，是=1）為因變量，基因分型為自變量，校正吸煙史、飲酒史、高血壓、糖尿病病史、認知功能障礙家族史、年齡、ALT及空腹血糖水平，進行Logistic回歸分析。結(jié)果顯示，冠心病患者中IL-35 基因rs428253、rs4740、rs2243115、rs568408、rs582054 及rs583911 位點多態(tài)性與認知功能障礙發(fā)生無明顯相關(guān)性，見表4。

3 討論

認知功能一般包括理解力、記憶力、注意力，是正確感知周圍環(huán)境、處理解決問題的基礎(chǔ)。而認知功能障礙作為老年期癡呆的前兆癥狀之一，是介于正常衰老和癡呆之間的一種認知損傷狀態(tài)，具有發(fā)展為癡呆的高度風(fēng)險，可嚴重影響中老年人群的健康及生活質(zhì)量，其患病率呈逐年遞增的趨勢［17-18］。有數(shù)據(jù)顯示，冠心病患者認知功能障礙的患病率較普通人群明顯增高，可達35%～46%，并且與認知功能障礙具有許多相同的危險因素，包括炎癥反應(yīng)、遺傳因素及血管性損傷等［19-20］。冠心病病理基礎(chǔ)為血管動脈粥樣硬化，炎癥反應(yīng)、遺傳因素及自身免疫調(diào)節(jié)失衡也已被證實與冠心病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。小膠質(zhì)細胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的天然免疫細胞，激活后可通過IL-1β、IL-6 及腫瘤壞死因子（TNF）-α等炎性因子的釋放，引起神經(jīng)元的丟失及變性，從而引起大腦的損傷，導(dǎo)致認知功能障礙。有研究發(fā)現(xiàn)，炎性因子IL-6-174G＞C位點C等位基因攜帶者較G 攜帶者IL-6 水平更高，并且隨訪1 年后認知功能損傷更重［21］。另有研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α-1031T/C 基因多態(tài)性與慢性精神分裂癥患者認知功能障礙發(fā)病風(fēng)險密切相關(guān)［22］。目前關(guān)于IL-35基因多態(tài)性與疾病易感性的關(guān)聯(lián)研究較少，尤其是與認知功能障礙的相關(guān)性，因此本研究對IL-35 基因多態(tài)性與冠心病患者認知功能障礙的發(fā)病風(fēng)險進行了探索。

Tab.3 The distribution of genotype in the two groups表3 2組基因型分布頻率［例（%）］

Tab.4 Association between interleukin-35 polymorphisms and the risk of cognitive impairment in CHD patients表4 冠心病患者IL-35 SNPs與認知功能障礙的相關(guān)性

IL-35 作為IL-12 家族的一員，主要由調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Treg）分泌，其在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)及自身免疫失衡中發(fā)揮著重要作用，與其受體結(jié)合后發(fā)揮抗炎及免疫抑制作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)冠心病患者IL-35 水平較對照組明顯降低，并且與冠心病患者LVEF 呈正相關(guān)［11，23］，提示IL-35在動脈硬化及冠心病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。故筆者推測IL-35可能也參與了血管性認知功能障礙的發(fā)生及發(fā)展。另外，研究發(fā)現(xiàn)IL-35 基因多態(tài)性與冠心病的發(fā)病風(fēng)險存在相關(guān)性，rs428253 位點CC基因型攜帶者冠心病的發(fā)病風(fēng)險較GG型攜帶者明顯增高［12-13］。同時IL-12A 作為IL-35 的亞基之一，一項對IL-12A rs2243115 及rs568408 基因多態(tài)性與中國北方漢族人群阿爾茨海默病的關(guān)聯(lián)性研究結(jié)果顯示，攜帶rs568408 TT基因型的研究對象與攜帶GG 基因型相比，阿爾茨海默病發(fā)病風(fēng)險明顯降低［6］。以上研究結(jié)果提示IL-35 分子相關(guān)基因位點多態(tài)性與動脈粥樣硬化性疾病及認知功能障礙存在關(guān)聯(lián)。但本研究結(jié)果顯示，病例組與對照組IL-35水平無明顯差異，且未發(fā)現(xiàn)IL-35 基因位點（rs428253、rs4740、rs2243115、rs568408、rs582054 及rs583911）多態(tài)性與冠心病患者認知功能障礙發(fā)病風(fēng)險相關(guān)。其原因可能包括：（1）認知功能障礙作為一種多因素疾病，單基因位點多態(tài)性可能通過影響蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄及表達從而參與疾病的發(fā)生發(fā)展，但這些位點多位于啟動子區(qū)或外顯子區(qū)；與此同時，單個基因或者遺傳變異對疾病發(fā)病風(fēng)險的影響較小，難以用于人群的早期疾病篩查和風(fēng)險預(yù)測，針對歐美人群的研究將與三酰甘油相關(guān)的3個基因共10個SNPs 及與低密度脂蛋白相關(guān)的3 個基因共10 個SNPs 等進行遺傳風(fēng)險評分，以此對SNPs 的累積效應(yīng)進行分析，發(fā)現(xiàn)該評分與各血脂水平密切相關(guān)，并且其累積效應(yīng)遠大于單個SNP 與血脂的相關(guān)性，提示SNPs 的累積效應(yīng)可增強遺傳變異對相關(guān)疾病發(fā)病風(fēng)險的評估和預(yù)測能力［24］。（2）基因-基因之間的協(xié)同作用和基因-環(huán)境交互作用在認知功能損傷發(fā)生發(fā)展中的重要性同樣值得關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，基因多態(tài)性與受教育水平之間的交互作用與認知功能損傷的風(fēng)險存在顯著相關(guān)［25］。（3）除此之外，Zhu等［6］關(guān)于IL-12A rs2243115及rs568408基因多態(tài)性與阿爾茨海默病關(guān)聯(lián)性的研究主要針對中國北方漢族人群，而本研究則主要為中國南方人群，研究結(jié)果提示不同的人種和人群，其基因遺傳背景存在差異，飲食習(xí)慣和生活方式也有所不同，因此對某些疾病的易感性也不盡相同。因此，深入探討基因多態(tài)性、基因-基因、基因-環(huán)境交互作用已成為目前認知功能損傷分子流行病學(xué)以及病因?qū)W研究的另一重點，對闡明認知功能損傷發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)機制具有重要意義。本研究雖然未發(fā)現(xiàn)IL-35 SNPs與冠心病患者認知功能障礙發(fā)生風(fēng)險的相關(guān)性，但為將來對不同區(qū)域、不同遺傳背景的人群制定不同重點的臨床防治工作具有一定的意義。

本研究仍存在一定不足：（1）認知功能障礙作為一項慢性疾病，其發(fā)生發(fā)展是一個漫長的過程，基因及環(huán)境等因素對其發(fā)生發(fā)展的影響可能需要進一步長期隨訪加以明確。（2）目前僅對IL-35 基因6 個SNP位點進行探討，在將來的研究中，應(yīng)進一步增加研究位點，以明確IL-35 基因位點多態(tài)性與認知功能障礙的相關(guān)性，為進一步防治認知功能障礙提供理論依據(jù)。