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        熱滅活副干酪乳桿菌Lc19對小鼠便秘的緩解作用研究

        2019-10-11 06:40:48陳建國李周勇李桂花周曉娟桑躍俞偉祖
        中國奶牛 2019年9期
        關(guān)鍵詞:墨汁干酪活菌

        陳建國,李周勇,李桂花,周曉娟,桑躍,俞偉祖

        (1.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)(集團(tuán))股份有限公司,呼和浩特 011500;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083;3.河北省畜產(chǎn)食品技術(shù)創(chuàng)新中心,廊坊 065201)

        隨著飲食結(jié)構(gòu)的改變及精神和社會壓力的增大,便秘已成為困擾現(xiàn)代人健康的主要問題之一,嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量。最近的調(diào)查顯示,在亞洲,便秘的發(fā)病率為9.6%,在歐美國家,便秘的發(fā)病率為8.1%[1]。在我國,便秘的發(fā)病率為5%~16%[2,3]。便秘的原因大多數(shù)為飲食不正常,通過改變飲食結(jié)構(gòu)來緩解便秘是一種安全又有效的方法。

        研究表明,通過口服活的益生菌,對腸道菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行平衡和調(diào)節(jié),可帶來顯著的通便效果,這已成為近年來健康治療功能性便秘大量采用的方法[4,5]。但是對于熱滅活的益生菌是否也能緩解便秘,國內(nèi)外文獻(xiàn)還鮮有報(bào)道。Takii等[6]研究了泡菜中活的和死的植物乳桿菌對于便秘人群的作用,結(jié)果表明兩種菌都可以緩解便秘。Katayama等[7]研究表明,熱滅活的副干酪乳桿菌可以緩解人群的便秘。益生菌緩解人群的便秘具有一定的菌株特異性,副干酪乳桿菌Lc19 (Lactobacillus para casei Lc19)是一株從長壽老人糞便中分離得到的益生菌株。本研究的目的是通過建立便秘小鼠模型評價(jià)活的與熱滅活的副干酪乳桿菌Lc19的潤腸通便功能,為益生菌乳飲料的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        BALB/c雄性小鼠,6~8周齡,體重18~22g,SPF級,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。副干酪乳桿菌Lc19,由蒙牛乳業(yè)集團(tuán)基礎(chǔ)科學(xué)部菌種中心提供。

        復(fù)方地芬諾酯片(批號1109026),為常州康普藥業(yè)有限公司產(chǎn)品;活性炭粉,為鞏義市嵩山濾材活性炭廠產(chǎn)品;阿拉伯樹膠,為廣東汕頭市西隴化工廠產(chǎn)品;MRS培養(yǎng)基,為北京奧博星生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

        1.2 儀器與設(shè)備

        SW-CJ醫(yī)用型潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);ZDX35BI高壓滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠);DNP9082恒溫培養(yǎng)箱、DHG-9076A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);3K30型低溫高速離心機(jī)、ACCULAB分析天平(德國Satorious公司)。

        1.3 方法

        1.3.1 溶液的配制

        活菌菌懸液的配制:將副干酪乳桿菌Lc19菌株用MRS液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)12h,4500r/min離心15min,菌體沉淀重懸于MRS液體培養(yǎng)基中,用生理鹽水配制不同濃度的菌懸液。

        熱滅活Lc19菌懸液的配制:將副干酪乳桿菌Lc19用MRS液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)12h,121℃、15min滅菌,然后4500r/min離心15min,菌體沉淀重懸于MRS液體培養(yǎng)基中,用生理鹽水配制不同濃度的菌懸液。

        墨汁的配制:準(zhǔn)確稱取阿拉伯樹膠100g,加水800mL,煮沸至溶液透明,稱取活性碳 (粉狀) 50g加至上述溶液中煮沸3次,待溶液冷卻后加水定容到1000mL,于冰箱中4℃保存,用前搖勻。

        復(fù)方地芬諾酯混懸液(0.05 g/100 m L及0.025g/100mL)的配制:分別取復(fù)方地芬諾酯片(每片含復(fù)方地芬諾酯2.5mg)20片、10片,用研缽研碎呈粉末后加水至50mL。臨用前配制。

        1.3.2 實(shí)驗(yàn)動物分組及處理

        實(shí)驗(yàn)小鼠分為死菌組、活菌組、空白組和模型組。死菌與活菌組分別設(shè)置高低兩個(gè)劑量組,分別灌胃4×109、4×1010CFU/mL的Lc19菌懸液0.1mL/(kg·d)(以體重計(jì),下同),空白組和模型組小鼠灌胃質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9%的生理鹽水0.1mL/(kg·d);每天一次,實(shí)驗(yàn)期間自由進(jìn)食,記錄各組小鼠體重變化。

        1.3.3 小鼠排便實(shí)驗(yàn)

        給受試樣品7d后,各組小鼠禁食不禁水16h。模型組、死菌組與活菌組小鼠灌胃給予復(fù)方地芬諾酯(10mg/kg),空白組給予生理鹽水。8×109、8×1010CFU/mL的Lc19死菌的菌懸液和8×109、8×1010CFU/mL的Lc19活菌的菌懸液,均與墨汁等體積混合,給予復(fù)方地芬諾酯0.5h后,空白組和模型組小鼠灌胃墨汁0.1mL/kg,益生菌Lc19活菌組與死菌組給予含受試樣品的墨汁0.1mL/kg,動物均單籠飼養(yǎng),正常飲水進(jìn)食。從灌胃墨汁開始,記錄每只動物首次排黑便時(shí)間、5h內(nèi)排黑便粒數(shù)、質(zhì)量。收集的糞便在105℃烘干至恒重,按式(1)計(jì)算糞便含水率。

        1.3.4 小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)

        給受試樣品15d后,各組小鼠禁食不禁水16h。模型組、死菌組與活菌組小鼠灌胃給予復(fù)方地芬諾酯(5mg/kg),空白組給予生理鹽水。給復(fù)方地芬諾酯0.5h后,Lc19活菌組與死菌組分別給予含受試樣品的墨汁0.1mL/kg(樣品劑量同1.3.3小鼠排便實(shí)驗(yàn)),對照組灌胃墨汁0.1mL/kg。25min后立即脫頸椎處死小鼠,打開腹腔分離腸系膜,剪取上端自幽門、下端至回盲腸部的腸管,置于托盤上,輕輕將小腸拉成直線,測量腸管長度為“小腸總長度”,從幽門至墨汁前沿為“墨汁推進(jìn)長度”。按式(2)計(jì)算墨汁推進(jìn)率。

        1.4 數(shù)據(jù)處理

        墨汁推進(jìn)率需進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換, ,式中:A為墨汁推進(jìn)率,結(jié)果用小數(shù)表示。在進(jìn)行方差分析時(shí),先使用方差分析程序做方差齊性檢驗(yàn),方差齊后,計(jì)算F值,F(xiàn)<0.05,則各實(shí)驗(yàn)組平均數(shù)間不存在顯著性差異,若F≥0.05、P≤0.05,表明各組均數(shù)之間存在顯著性差異;用一個(gè)對照組同每個(gè)實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)進(jìn)行秩和t檢驗(yàn)。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 小鼠體重變化

        表2 Lc19對便秘模型小鼠各排便指標(biāo)的影響 (n=10)

        表1 實(shí)驗(yàn)小鼠體重變化 (n=10)

        由表1可知,試驗(yàn)期間小鼠的體重在各劑量試驗(yàn)組與空白組間比較,均不存在顯著性差異(P>0.05),表明試驗(yàn)過程中副干酪乳桿菌Lc19對雄性小鼠的體重沒有顯著性影響,本研究是在小鼠生理常態(tài)條件下進(jìn)行的。

        2.2 小鼠排便實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        實(shí)驗(yàn)小鼠每天一次經(jīng)口灌胃副干酪乳桿菌Lc19的活菌體與死菌體,連續(xù)7d后測定對便秘模型小鼠首次排黑便時(shí)間、5h內(nèi)排黑便粒數(shù)、質(zhì)量及糞便含水率的影響,結(jié)果見表2。與空白組比較,模型組小鼠首次排黑便時(shí)間、5h內(nèi)排黑便粒數(shù)、排便質(zhì)量和糞便含水率均有極顯著性差異(P<0.01),說明便秘小鼠模型成立。

        由表2可知,Lc19的活菌體與死菌體經(jīng)口灌胃7d后,對于首次排黑便時(shí)間,活菌組、死菌組與模型組相比具有極顯著差異(P<0.01),活菌組低于死菌組;對于5h內(nèi)黑便質(zhì)量,活菌組與死菌高劑量組與模型組相比具有極顯著差異(P<0.01),死菌低劑量組與模型組具有顯著差異(P<0.05),活菌組高于死菌組;對于5h內(nèi)黑便粒數(shù),活菌組、死菌組與模型組相比具有極顯著差異(P<0.01),活菌組高于死菌組;對于糞便含水率,活菌組、死菌組與模型組相比沒有顯著差異(P>0.05)。

        2.3 小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        小腸運(yùn)動有3種方式,即張力收縮、分節(jié)運(yùn)動和蠕動,主要以蠕動力推動腸內(nèi)容物運(yùn)動為主要方式[10]。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)口灌胃給予小鼠止瀉劑復(fù)方地芬諾酯是一種便秘模型造模常用藥物[11],其作用主要是直接作用于腸道平滑肌,通過抑制腸黏膜感受器,消除局部腸黏膜蠕動反射而使腸道蠕動減慢,使腸內(nèi)容物通過延遲,致使小鼠排便困難,與便秘臨床癥狀相近。經(jīng)灌胃建立小鼠小腸蠕動抑制模型后,再通過墨汁標(biāo)記觀察Lc19活菌體與死菌體對便秘小鼠腸道蠕動的影響。實(shí)驗(yàn)小鼠連續(xù)灌胃副干酪乳桿菌Lc19的活菌體與死菌體15d后,進(jìn)行小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表3。

        表3 Lc19對便秘小鼠小腸墨汁推進(jìn)率的影響 (n=10)

        由表3可知,模型組墨汁推進(jìn)率明顯低于空白組(P<0.01),墨汁推進(jìn)實(shí)驗(yàn)小鼠便秘模型造模成功。灌胃15d后,活菌組、死菌高劑量組小腸推進(jìn)率與模型組相比,極顯著增加(P<0.01),死菌低劑量組顯著增加(P<0.05),且出現(xiàn)劑量效應(yīng),隨菌濃度的提高,便秘小鼠的墨汁推進(jìn)率增加。

        3 結(jié)論

        本試驗(yàn)通過灌胃復(fù)方地芬諾酯建立小鼠的便秘模型,以小鼠的首次排便時(shí)間、排便粒數(shù)和質(zhì)量、糞便水分含量和墨汁推進(jìn)率等指標(biāo)評價(jià)活的與熱滅活的副干酪乳桿菌Lc19對便秘模型小鼠的通便功能。綜合試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出,Lc19的活菌體與死菌體都可以改善便秘模型小鼠的排便能力?;罹w與死菌體相比可以顯著改善便秘模型小鼠的排便能力,活菌組與死菌組改善便秘的能力均存在劑量效應(yīng),活菌高劑量組改善便秘的能力大于低劑量組,死菌高劑量組改善小鼠便秘的能力大于低劑量組。

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