何芳，伍佰鑫，周望平，浣成，羅陽(yáng)

（湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，長(zhǎng)沙 410131）

奶牛乳房炎是目前奶牛群中發(fā)病率最高、花費(fèi)最多、淘汰率最高、損失最嚴(yán)重的疾病，嚴(yán)重制約著奶牛業(yè)的發(fā)展。據(jù)統(tǒng)計(jì)我國(guó)奶牛場(chǎng)乳房炎疾病的發(fā)病率為46%～70%，造成的經(jīng)濟(jì)損失可達(dá)30億美元，且每年用于乳房炎防控經(jīng)費(fèi)支出約2080萬(wàn)美元，嚴(yán)重影響著我國(guó)奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[1]。李樹(shù)梅等[2]在河北地區(qū)720份乳樣中檢測(cè)出182份隱性乳房炎，發(fā)病率為25.3%，其中主要致病菌為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無(wú)乳鏈球菌和溶血葡萄球菌。楊興斌[3]利用LMT法對(duì)甘肅地區(qū)6家奶牛場(chǎng)共240份乳樣進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有118份為隱性乳房炎，平均檢出率49.17%，且檢出率與其胎次呈正相關(guān)。目前，奶牛乳房炎主要使用抗生素以乳頭灌注的方法給藥進(jìn)行治療，長(zhǎng)期使用抗生素導(dǎo)致了奶牛乳腺泌乳能力下降，還造成了嚴(yán)重的耐藥性和藥物殘留，嚴(yán)重影響著人們的健康[4]。有試驗(yàn)表明，奶牛乳房炎病原菌對(duì)青霉素等常用抗菌藥產(chǎn)生了不同程度的耐藥性，耐藥率最高(青霉素)達(dá)61.64%[5]。

中草藥富含多種抑菌或者殺菌的活性物質(zhì)，對(duì)病原菌有直接或者間接的殺滅作用，具有無(wú)殘留、無(wú)耐藥性等多種優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于畜禽疾病防治[6]。研究表明中藥對(duì)防治奶牛乳房炎有著殘留低、刺激性小、效果好的優(yōu)點(diǎn)。張寶靜等[7]認(rèn)為中草藥在治療乳腺炎時(shí)療效高于抗生素，而抗生素組療效較低的原因，可能與長(zhǎng)期使用抗生素而產(chǎn)生抗藥性有關(guān)。但是目前，中草藥制劑穩(wěn)定性較差，方劑種類較少、配方?jīng)]有明確標(biāo)準(zhǔn)，操作較麻煩。本研究旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，研制一種中藥噴霧劑，為中草藥在防治奶牛乳房炎方面的研究提供參考。

1 材料

1.1 藥品

半枝蓮、蒲公英、木芙蓉、蘇木、黃柏、青皮，八角楓、木別子、熟地、皂刺、木貝母、赤芍、野菊花、夏枯草、暮草、八角蓮、兩面針、金銀花藤、青皮樹(shù)枝葉、白花、腫節(jié)風(fēng)連錢草、地丁草、八角楓葉、號(hào)桐桿等25種中草藥，均購(gòu)置于湖南中藥材市場(chǎng)。

1.2 主要培養(yǎng)基

血瓊脂培養(yǎng)基，普通瓊脂培養(yǎng)基，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸膏（均為分析純），購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 奶牛乳房炎病原菌

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌，為湖南省畜牧獸醫(yī)研究所分離、保存的菌株。

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物均來(lái)自湖南省畜牧獸醫(yī)研究所奶牛原種場(chǎng)。

2 方法

2.1 防治奶牛乳房炎中草藥的體外篩選方法

2.1.1 中草藥的提取

將中草藥用75%的醫(yī)用酒精浸泡3～4d，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，回收酒精。重復(fù)3次，將三次得到的藥液混合。將浸泡后的藥物殘?jiān)龠M(jìn)行水煎提取3次。最后將醇提液和水煎藥物合并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至100mL（1g生藥/mL），過(guò)濾，滅菌，放置冰箱備用。

2.1.2 菌液的制備

取生長(zhǎng)于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（鏈球菌為血液培養(yǎng)基）上的試驗(yàn)菌，用接種環(huán)蘸取少量菌落，接種于4～5mL的普通肉湯中，35℃孵育2～6h。增菌后的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液用生理鹽水或肉湯校正濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，使其含菌1～2×108CFU/mL。

2.1.3 中草藥體外抑菌作用的測(cè)定

采用藥物紙片瓊脂擴(kuò)散法。將浸有中草藥的紙片（直徑為6mm）貼在平皿上，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h（鏈球菌培養(yǎng)24h）后測(cè)定抑菌圈直徑。并以0.1g/mL的氨芐西林鈉作為對(duì)照。

2.1.4 最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）的測(cè)定

對(duì)體外抑菌試驗(yàn)效果明顯的幾種中草藥進(jìn)行最低抑菌濃度和最低殺菌濃度的測(cè)定，采用管碟法：取9支試管，每支試管加液體培養(yǎng)基4.0mL，滅菌后備用。將滅菌的藥物4.0mL加入第一支試管中混勻，依次將藥物二倍稀釋，共稀釋成8個(gè)不同濃度后，第1～8管藥物濃度分別為20、2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7g/mL。第9支試管為液體培養(yǎng)基陰性對(duì)照。第1～8管每支試管再加入0.02mL菌懸液，培養(yǎng)24h。以肉眼觀察不顯示濁度、藥物濃度最小的一管作為MIC；分別取不顯示濁度試管中的肉湯0.05mL接種培養(yǎng)平板上，再培養(yǎng)24h，以無(wú)菌落或菌落生長(zhǎng)數(shù)≤10的培養(yǎng)板所對(duì)應(yīng)的最小藥物濃度為MBC。

2.2 防治奶牛乳房炎復(fù)方中草藥制劑的制備

2.2.1 中藥組方

在單味藥抗菌活性的基礎(chǔ)上，根據(jù)奶牛乳房炎的發(fā)病機(jī)理、中獸醫(yī)學(xué)理論和藥劑學(xué)理論，以傳統(tǒng)經(jīng)典組方瓜蔞散為基礎(chǔ)，進(jìn)行加減，選用對(duì)四種病原菌表現(xiàn)出較好抑菌效果的中草藥組成復(fù)方。

2.2.2 復(fù)方中草藥噴霧劑的制備

中草藥復(fù)方經(jīng)醇提和水煮合并以后，加熱濃縮成浸膏。再緩慢加到配制好的復(fù)合溶媒（蒸餾水:無(wú)水乙醇:助溶劑）中，直至達(dá)到飽和為止。用3號(hào)耐酸過(guò)濾器濾去未溶解的藥物殘?jiān)?。最后加?%的促滲劑和0.1%的高錳酸鉀。

2.3 復(fù)方中草藥噴霧劑對(duì)奶牛臨床型乳房炎的治療

表125種中草藥對(duì)四種病原菌的平均抑菌直徑 單位：mm

2.3.1 試驗(yàn)方法

奶牛乳區(qū)臨床表現(xiàn)出紅、腫、熱、痛，奶汁稀薄，或帶有絮狀物、膿塊、血色的診斷為臨床型乳房炎患乳區(qū)。從2017年9～11月兩個(gè)月的時(shí)間內(nèi)，對(duì)在湖南省畜牧獸醫(yī)研究所奶牛原種場(chǎng)發(fā)現(xiàn)的患牛，一經(jīng)確診后馬上用試驗(yàn)藥物進(jìn)行治療，每天上下午各一次噴藥物于患乳房基部，連續(xù)用藥，未治愈的繼續(xù)給藥。共有18頭奶牛18個(gè)患乳區(qū)進(jìn)入試驗(yàn)。

2.3.2 判斷標(biāo)準(zhǔn)

痊愈判定標(biāo)準(zhǔn)：食欲正常，乳區(qū)的紅、腫、熱、痛消失，肉眼觀察乳汁正常，產(chǎn)奶量恢復(fù)至正常水平。無(wú)效判定標(biāo)準(zhǔn)：用藥5d后，乳區(qū)的紅、腫、熱、痛消失不明顯，乳汁仍異常，產(chǎn)奶量沒(méi)有恢復(fù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 防治奶牛乳房炎中草藥篩選結(jié)果

3.1.125種中草藥體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果

從表1中可以看出半枝蓮、赤芍、蘇木、黃柏、木芙蓉、熟地、蒲公英7種中草藥對(duì)四種病原菌都表現(xiàn)出了較好的抑菌效果，而青皮、八角楓葉、八角蓮、兩面針、地丁草、八角楓根、號(hào)桐桿對(duì)四種病原菌體外抑菌效果不明顯。體外抑菌試驗(yàn)是藥物篩選的初步條件，因此可將半枝蓮、赤芍、蘇木、黃柏、木芙蓉、熟地、蒲公英作為防治奶牛乳房炎制劑研制開(kāi)發(fā)的主藥。

3.1.2 最低抑菌濃度和最低殺菌濃度測(cè)定結(jié)果

表27種中草藥對(duì)4種致病菌的MIC和MBC 單位：g/mL

特別觀察上述細(xì)菌抑菌圈實(shí)驗(yàn)篩選出的7種藥的MIC與MBC，結(jié)果如表2所示。

3.2 中草藥復(fù)方噴霧劑治療奶牛臨床型乳房炎的臨床試驗(yàn)結(jié)果

由表3顯示結(jié)果可以看出中草藥復(fù)方噴霧劑對(duì)奶牛臨床型治療乳房炎的治愈率達(dá)到88.9%，有效率為100%，表現(xiàn)出了較好的治療效果。在試驗(yàn)過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，與抗生素聯(lián)合用藥可大大縮短治療療程。同時(shí)對(duì)于抗生素長(zhǎng)期治療無(wú)效的頑固性乳房炎，改用試驗(yàn)用的中草藥復(fù)方噴霧劑和抗生素聯(lián)合用藥治療，表現(xiàn)出了良好的治療效果。

表3 中草藥復(fù)方噴霧劑治療奶牛臨床型乳房炎的效果

4 討論

奶牛乳房炎是奶牛的一種常見(jiàn)疾病，每年都會(huì)給全世界奶業(yè)及養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的損失，包括產(chǎn)奶量降低、乳品質(zhì)下降以及生產(chǎn)成本的提高[8]。造成奶牛乳房炎的因素很多，其中，病原微生物感染是其主要病因。多種病原菌均可以引起奶牛乳房炎，其中以鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌（E.coli）為主，大腸桿菌引起的乳房炎多見(jiàn)于高產(chǎn)奶牛及產(chǎn)后泌乳高峰期奶牛[9,10]。

我國(guó)一般使用抗生素以乳頭灌注的方法治療奶牛乳房炎，但長(zhǎng)期大量使用抗生素，不僅使奶牛的乳腺泌乳能力下降，使病原菌產(chǎn)生耐藥性，增加了治療的難度，同時(shí)造成了嚴(yán)重藥物殘留，影響牛奶的品質(zhì)和人們的健康[11]。藥物殘留、環(huán)境污染等問(wèn)題已引起全社會(huì)高度關(guān)注，研究可替代抗生素類的新型藥物已成為新課題。中草藥富含多種抑菌或者殺菌的活性物質(zhì)，對(duì)病原菌有直接或者間接的殺滅作用，兼有藥物和營(yíng)養(yǎng)雙重功效，具有低毒、低殘留，不易產(chǎn)生耐藥性、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的焦點(diǎn)。專家學(xué)者在應(yīng)用中草藥防治奶牛乳房炎方面進(jìn)行了大量研究，取得了一系列成果。研究發(fā)現(xiàn)，單味中草藥在防治奶牛乳房炎的過(guò)程中，常存在用量大、效果不明顯、利用率低等缺點(diǎn)[12]。而復(fù)方中草藥制劑可以提高治療效果，減少單味中草藥的毒性，彌補(bǔ)單味中草藥防治奶牛乳房炎的不足。復(fù)方中草藥制劑在機(jī)體內(nèi)不僅可以直接抑制或者殺滅導(dǎo)致乳房炎的病原菌，而且可以提高機(jī)體的免疫力，調(diào)節(jié)機(jī)體的新陳代謝，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收。多項(xiàng)研究證實(shí)了中草藥及其復(fù)方制劑在防治奶牛乳房炎方面具有很好的效果。葉文初等[13]報(bào)道了苦豆草提取物對(duì)奶牛乳房炎致病菌具有很好的體外抑菌效果。郝景鋒等[14]研究表明蒲公英、魚腥草、益母草、紅花、金銀花等5味中藥對(duì)奶牛隱性乳房炎3種病原菌的綜合抑制效果較好。路孝兵[12]報(bào)道了中藥蒲和飲透皮劑對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌引起的奶牛乳房炎具有很好的治療效果。曲家華等[15]報(bào)道，蒲公英、金銀花、連翹等組方的中草藥粉劑“乳康健”對(duì)奶牛隱性乳房炎有良好的治療作用，日糧中添加500g/（頭·d）飼喂7d，乳區(qū)陽(yáng)性率由29.17%下降為8.33%。賈麗萍等[16]比較了灌服蒲公英散( 蒲公英、全瓜蔞、銀花等組方)與乳頭孔注入氯唑西林鈉治療乳房炎的療效，結(jié)果顯示3個(gè)療程（1個(gè)療程5d）的有效率和治愈率蒲公英散比氯唑西林鈉分別高了16.1和20.4個(gè)百分點(diǎn)（P＜0.05），復(fù)發(fā)率低了9.2個(gè)百分點(diǎn)（P＜0.05）。呂平等[17]研究發(fā)現(xiàn)，苦丁茶、蒲公英、丁香的提取物和溶菌酶組合的復(fù)合物對(duì)臨床型奶牛乳房炎病原菌金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、無(wú)乳鏈球菌有明顯體外抑制作用。

本臨床試驗(yàn)結(jié)果表明：以半枝蓮、赤芍、蘇木、黃柏、木芙蓉、熟地、蒲公英等數(shù)味藥制備成的中草藥噴霧劑對(duì)臨床型奶牛乳房炎的治愈率達(dá)到88.9%，有效率為100%，表現(xiàn)出了較好的治療效果。在試驗(yàn)過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，與抗生素聯(lián)合用藥可大大縮短治療療程。同時(shí)對(duì)于抗生素長(zhǎng)期治療無(wú)效的頑固性乳房炎，改用試驗(yàn)用的中草藥復(fù)方噴霧劑和抗生素聯(lián)合用藥治療，表現(xiàn)出了良好的治療效果。