刁小琴，關(guān)海寧，李楊，劉麗美

(綏化學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院，黑龍江 綏化,152061)

肌原纖維蛋白(myofibrillar protein，MP)是豬肌肉總蛋白的50%～55%[1]，它具有的持水性、乳化性及凝膠性等功能特性，影響著肉制品的彈性、黏合性以及質(zhì)地，決定產(chǎn)品的最終品質(zhì)。為了更好地發(fā)揮肌原纖維蛋白的功能特性，常采用物理改性、化學(xué)改性、酶改性等技術(shù)對(duì)其進(jìn)行修飾。高壓均質(zhì)是近些年發(fā)展起來的一種高新改性技術(shù)，它利用均質(zhì)過程產(chǎn)生的空化、剪切、湍流等作用改變蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特性[2]。

關(guān)于高壓均質(zhì)的研究報(bào)道已有很多[3-8]，但目前國內(nèi)外尚未有關(guān)于豬肉肌原纖維蛋白經(jīng)高壓均質(zhì)處理后乳化特性改善的研究報(bào)道，同時(shí)在實(shí)際生產(chǎn)中，受機(jī)械設(shè)備的限制，部分均質(zhì)機(jī)的均質(zhì)壓力一般不超過40 MPa，本研究采用均質(zhì)壓力(20 MPa和40 MPa)、均質(zhì)次數(shù)(1次和2次)對(duì)肌原纖維蛋白進(jìn)行改性，并研究其結(jié)構(gòu)的變化，以期為高壓均質(zhì)應(yīng)用于肌原纖維蛋白的實(shí)際生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮的豬背最長肌，黑龍江北大荒肉業(yè)有限公司；大豆色拉油，安徽中糧油脂有限公司；乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)，北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)(分析純)，上海源葉生物有限公司；8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)，上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司；牛血清蛋白，北京索萊寶科技有限公司。

酒石酸鉀鈉、無水CESO4、NaOH、Na2HPO4、NaH2PO4、NaCL等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SRH60-70高壓均質(zhì)機(jī)，上海申鹿均質(zhì)機(jī)有限公司；T18 basic型勻漿機(jī)，德國IKA公司；Mastersizer 3000型馬爾文激光粒度儀，英國馬爾文公司；Zetasizer Nano型馬爾文電位儀，英國馬爾文公司；TU-190雙光束紫外-可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；GL-21M型高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司；F96S熒光分光光度計(jì)，上海棱光技術(shù)有限公司；AVATAR360傅立葉變換紅外光譜儀，美國Nicolet公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的高壓均質(zhì)處理

參照GUO等[9]的方法從豬背最長肌中提取肌原纖維蛋白，具體操作如下：將除去脂肪和結(jié)締組織的肉樣絞碎，用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(含NaCl、MgCl2和EGTA，pH 7.0)低溫提取3次，沉淀用0.1 mol/L NaCl洗液洗滌2次后，加入NaCl洗液，勻漿60 s，4層紗布過濾，濾液分成5份，其中1份不經(jīng)均質(zhì)處理作對(duì)照，剩余4份進(jìn)行不同條件的高壓均質(zhì)處理(20 MPa 均質(zhì)1次和2次；40 MPa均質(zhì)處理1次和2次，后續(xù)用20-1、20-2、40-1、40-2表示)，隨后用0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至6.0，3 500 r/min冷凍(4 ℃)離心15 min，取沉淀，真空冷凍干燥備用。以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，采用雙縮脲法測(cè)定蛋白含量[10]。

1.3.2 溶解性測(cè)定

將不同均質(zhì)處理的MP配成10 g/L的溶液，4 000 r/min離心40 min后，用雙縮脲法測(cè)定上清液的吸光值，溶解度用上清液的蛋白含量與樣品中的總蛋白含量的百分比來表示。

1.3.3 粒徑測(cè)定

將不同均質(zhì)處理的MP配成1 g/L的溶液，室溫(25 ℃)環(huán)境下，以蒸餾水作為分散介質(zhì)，采用激光粒度分析儀測(cè)定粒徑大小和分布，測(cè)定結(jié)果以體積等效平均粒徑(D4,3)表示。

1.3.4 乳化活性及乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

參照RAMIREZ-SUAREZ等[11]的方法，將8 mL 10 mg/mL的MP溶液與2 mL大豆色拉油混勻后用高速分散均質(zhì)機(jī)10 000 r/min勻漿1 min，立即從底部0.5 cm處取50 μL乳化液與5 mL SDS溶液(濃度為1 mg/g)混勻，在500 nm波長下測(cè)其吸光值。同時(shí)，測(cè)定室溫放置10 min后的樣品。乳化活性(EAI)和乳化穩(wěn)定性(ESI)按式(1)和(2)計(jì)算：

(1)

(2)

式中：ρ，乳化前的蛋白質(zhì)量濃度，g/mL；φ，乳化液中油的體積比；n，稀釋倍數(shù)；A0，初始乳化液在500 nm波長下的吸光度；A10，10 min后乳化液500 nm處的吸光度。

1.3.5 乳化液電位測(cè)定

將 50 μL不同均質(zhì)處理的MP乳化液與5 mL磷酸鹽緩沖液(pH 7.0，10 mmol/L)混勻后注入彎曲毛細(xì)管樣品池中，使用馬爾文激光粒度儀在常溫下測(cè)定乳化液電位。

1.3.6 總巰基和活性巰基的測(cè)定

參照BEVERIDGE等[12]的方法測(cè)定。將15 mg樣品用5.0 mL緩沖液(0.086 mol/L Tris, 0.09 mol/L甘氨酸, 4 mmol/L EDTA, pH 8.0)溶解，用于總巰基含量測(cè)定的緩沖液中包含8 mol/L的尿素，用于活性巰基含量測(cè)定的緩沖液中不包含尿素。然后加入50 μL 的Ellman試劑，漩渦混勻后避光反應(yīng)1 h，10 000 r/min 離心15 min(4 ℃)。測(cè)上清液的蛋白含量及在412 nm處的吸光值。總巰基和活性巰基含量使用2-硝基-5-硫代苯甲酸(NTB)的摩爾消光系數(shù)13 600 mol/(L·cm) 計(jì)算，單位為μmoL/g。

1.3.7 表面疏水性的測(cè)定

根據(jù)KATO等[13]的方法，以ANS為熒光探針，利用熒光分光光度計(jì)測(cè)定不同均質(zhì)處理后的蛋白質(zhì)的表面疏水性。蛋白質(zhì)量濃度被稀釋在5～500 μg/mL，激發(fā)波長和發(fā)射波長分別設(shè)置為365 nm和484 nm。以蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，所得曲線的斜率即為表面疏水性指數(shù)。

1.3.8 紅外光譜分析

真空冷凍干燥后的樣品粉末與溴化鉀混合研磨并壓片，恒溫箱里平衡5 min，紅外光譜儀掃描，范圍4 000～600 cm-1，分辨率4 cm-1，每個(gè)樣品圖譜掃描重復(fù)3次，采集紅外光譜圖。利用OMNIC 8.0對(duì)圖譜進(jìn)行處理后，使用Peak fit 4.2軟件對(duì)1 600～1 700 cm-1酰胺I段的圖譜進(jìn)行分析，經(jīng)過圖譜過濾、平滑和基線校正處理后，用Gaussian函數(shù)對(duì)圖譜進(jìn)行去卷積、二階求導(dǎo)，估計(jì)出各個(gè)疊加的子峰個(gè)數(shù)和峰位，通過二階導(dǎo)數(shù)多次擬合直至殘差最小，確認(rèn)各子峰位歸屬，α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲含量的相對(duì)含量根據(jù)各子峰的積分面積計(jì)算[14]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均數(shù)±SD。差異顯著性分析采用Statistix 8.1軟件進(jìn)行，作圖采用Sigmaplot 12.5軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 高壓均質(zhì)對(duì)肌原纖維蛋白功能特性的影響

2.1.1 高壓均質(zhì)對(duì)肌原纖維蛋白溶解性的影響

溶解性是蛋白質(zhì)水化作用的重要體現(xiàn)，蛋白質(zhì)的水化作用加強(qiáng)，其溶解度升高，蛋白質(zhì)的高溶解性對(duì)肉制品加工至關(guān)重要。不同均質(zhì)壓力與次數(shù)對(duì)肌原纖維蛋白溶解性的影響見圖1。

經(jīng)均質(zhì)壓力為20 MPa和40 MPa，均質(zhì)次數(shù)為1次和2次的處理組，其溶解度均顯著優(yōu)于未經(jīng)高壓均質(zhì)處理的對(duì)照組(P< 0.05)，其中經(jīng)40 MPa均質(zhì)1次的處理組其溶解度表現(xiàn)為最高。溶解度提高的原因可能是肌原纖維蛋白受到強(qiáng)烈剪切和振蕩等作用，其緊密結(jié)構(gòu)逐漸展開，蛋白質(zhì)內(nèi)部的極性基團(tuán)裸露出來，表面電荷增多，結(jié)合于新暴露的極性基團(tuán)的水也增多，蛋白質(zhì)的水化作用加強(qiáng)，其溶解度上升[15]。當(dāng)均質(zhì)次數(shù)增加時(shí)，溶解度反而降低，可能是由于多次均質(zhì)使蛋白分子過度展開，疏水作用增強(qiáng)，形成了難溶的聚集體，因而溶解度下降，故選擇1次均質(zhì)最為適宜[16]。FLOUR等[17]采用高于150 MPa的均質(zhì)壓力處理大豆球蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其溶解性喪失，分析原因也可能是蛋白發(fā)生聚集所導(dǎo)致。

圖1 高壓均質(zhì)對(duì)肌原纖維蛋白溶解性的影響Fig.1 Effect of high pressure homogenization treatment on solubility of MP注：圖中不同小寫字母表示差異顯著，下同。

2.1.2 高壓均質(zhì)對(duì)肌原纖維蛋白粒徑的影響

粒徑分布能夠反映蛋白的聚集程度。由圖2可以看出，與未經(jīng)高壓均質(zhì)處理的對(duì)照相比，均質(zhì)處理的蛋白，其粒徑均朝著粒徑變小的方向移動(dòng)，且均質(zhì)壓力越高，移動(dòng)越明顯，40 MPa均質(zhì)處理1次的變化效果最顯著。圖3體積平均粒徑D4，3也表明，隨著均質(zhì)壓力的增加，D4，3顯著降低，40 MPa均質(zhì)處理1次的D4，3最小，說明高壓均質(zhì)能夠使蛋白分子發(fā)生解聚，使其粒徑變小。DUMAY等[18]也報(bào)道高壓均質(zhì)產(chǎn)生的機(jī)械力破壞了蛋白結(jié)構(gòu)，使其粒徑減小。

圖2 高壓均質(zhì)對(duì)肌原纖維蛋白粒徑分布的影響Fig.2 Effect of high pressure homogenization treatment on particle size distribution of MP

圖3 高壓均質(zhì)對(duì)肌原纖維蛋白粒徑的影響Fig.3 Effect of high pressure homogenization treatment on particle size of MP

2.1.3 高壓均質(zhì)對(duì)肌原纖維蛋白乳化活性及乳化穩(wěn)定性的影響

乳化能力指乳狀液在相轉(zhuǎn)變前每克蛋白質(zhì)所能乳化油的體積。肉的乳化能力主要表現(xiàn)在肉中蛋白質(zhì)固定脂肪的能力，乳化能力高意味著能夠固定更多的脂肪，也意味著加工制成穩(wěn)定的乳化肉產(chǎn)品時(shí)能夠減少跑油的現(xiàn)象。高壓均質(zhì)對(duì)肌原纖維蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響見圖4。

圖4 高壓均質(zhì)對(duì)肌原纖維蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of high pressure homogenization treatment on emulsifying activity and emulsion stability of MP

由圖4可以看出，經(jīng)均質(zhì)壓力20 MPa和40 MPa，均質(zhì)次數(shù)為1次和2次的處理組，其乳化活性均優(yōu)于未經(jīng)高壓均質(zhì)處理的對(duì)照組，其中經(jīng)40 MPa均質(zhì)1次的處理組其乳化活性表現(xiàn)最高，乳化值達(dá)到47.45 m2/g，這與溶解性的結(jié)果相一致?？赡苁怯捎诘鞍踪|(zhì)溶解性提高，會(huì)使更多的蛋白溶于水，進(jìn)而加快了蛋白的遷移，使更多的蛋白吸附到油水界面，從而乳化活性提高。然而相同的均質(zhì)壓力下，均質(zhì)2次的乳化活性均低于均質(zhì)1次，這可能是多次均質(zhì)使得疏水作用增強(qiáng)，進(jìn)而形成不溶的聚集物，降低了蛋白遷移到油水界面的機(jī)率，乳化活性降低。乳化穩(wěn)定性隨著均質(zhì)壓力的變化趨勢(shì)與乳化活性變化趨勢(shì)相似。

2.1.4 高壓均質(zhì)對(duì)肌原纖維蛋白乳化液電位的影響

乳化液滴表面的帶電性質(zhì)能夠反映液滴間的相互作用，進(jìn)而說明乳化液的乳化能力。乳化液滴表面電荷的多少可通過電位來反映。電位的正負(fù)通常是由乳液所處的pH值決定，乳液的pH高于蛋白等電點(diǎn)，乳液就帶負(fù)電荷，低于蛋白等電點(diǎn)，乳液就帶正電荷[19]。

圖5 高壓均質(zhì)對(duì)肌原纖維蛋白電位的影響Fig.5 Effect of high pressure homogenization treatment on zeta potential of MP

圖5中未經(jīng)高壓均質(zhì)處理的MP的電位為(-13.1±0.954)mV，隨著均質(zhì)壓力的增加，電位絕對(duì)值顯著升高，說明表面帶的負(fù)電荷逐漸增強(qiáng)，液滴間的靜電斥力增強(qiáng)，進(jìn)而阻礙了液滴間的聚集，使乳液的穩(wěn)定性增強(qiáng)，這與乳液穩(wěn)定性結(jié)果相一致。

2.2 高壓均質(zhì)對(duì)肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 高壓均質(zhì)對(duì)肌原纖維蛋白總巰基和活性巰基的影響

總巰基指位于蛋白質(zhì)分子表面的活性巰基和包埋于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的巰基，即蛋白質(zhì)分子的所有巰基，活性巰基指暴露于蛋白質(zhì)分子表面的巰基[20]。巰基含量的變化反映蛋白的結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)[21]。隨著均質(zhì)壓力的增加，肌原纖維蛋白總巰基呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢(shì)，而活性巰基呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)楦邏壕|(zhì)使蛋白分子結(jié)構(gòu)變得松散，埋藏于分子內(nèi)部的巰基基團(tuán)逐漸暴露于表面，并隨著壓力的增加暴露逐漸增加，然而當(dāng)均質(zhì)壓力為40 MPa，均質(zhì)2次時(shí)，活性巰基含量開始減少，究其原因，可能是多次均質(zhì)使蛋白分子結(jié)構(gòu)因聚集而變得緊密，進(jìn)而使活性巰基含量減少。

圖6 高壓均質(zhì)對(duì)肌原纖維蛋白總巰基和活性巰基的影響Fig.6 Effect of high pressure homogenization treatment on total sulfhydryl content and exposed sulfhydryl content of MP

另外，處理過程是在空氣中進(jìn)行的，暴露于表面的巰基易氧化生成二硫鍵，從而使總巰基含量下降。

2.2.2 高壓均質(zhì)對(duì)肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

表面疏水性反映蛋白質(zhì)表面疏水性氨基酸的相對(duì)含量，對(duì)維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的穩(wěn)定具有重要的作用，在一定程度上能夠表征蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變。由圖7可以看出，隨著均質(zhì)壓力及次數(shù)的增加，表面疏水性呈上升趨勢(shì)，可能是高壓處理破壞了蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，使其解折疊，進(jìn)而蛋白內(nèi)部的疏水性氨基酸如色氨酸和苯丙氨酸等殘基暴露于蛋白表面，增加了蛋白的表面疏水性。KO等[22]研究發(fā)現(xiàn)高壓處理羅非魚肌動(dòng)球蛋白后其表面疏水性增加，張自業(yè)[23]采用超高壓處理雞肉肌原纖維蛋白，也得出表面疏水性增加的結(jié)論。另外，張晶等報(bào)道80 MPa的壓力處理大米蛋白，其表面疏水性增加，乳化活性得到改善。也有研究報(bào)道，表面疏水性增加，能夠降低界面張力，增加蛋白質(zhì)與油脂之間的相互作用，利于乳化層形成，進(jìn)而使其乳化性提高[24]，本研究也得到類似的結(jié)論。

圖7 高壓均質(zhì)對(duì)肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig.7 Effect of high pressure homogenization treatment on surface hydrophobicity of MP

2.2.3 高壓均質(zhì)處理后肌原纖維蛋白的紅外光譜分析

圖8 高壓均質(zhì)處理后的肌原纖維蛋白紅外光譜圖Fig.8 FT-IR spectroscopy of MP after high pressure homogenization treatment

由圖9也可以看出，隨著均質(zhì)壓力的增加，α-螺旋和β-折疊含量減少，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲含量增加，表明高壓均質(zhì)使α-螺旋和β-折疊向β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)化，蛋白分子由有序向無序結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。

圖9 高壓均質(zhì)處理后的肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的變化Fig.9 The secondary structure contents changes of MP after high pressure homogenization treatment

這可能是隨著均質(zhì)壓力的增大，肌原纖維蛋白分子間的氫鍵作用減小，分子間的相互作用減弱，蛋白質(zhì)分子展開，結(jié)構(gòu)變得松散，蛋白內(nèi)部的非極性基團(tuán)暴露，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，表現(xiàn)為α-螺旋、β-折疊含量的降低以及表面疏水性的增加。王辰等[28]采用紅外光譜分析大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白的表面疏水性與α-螺旋呈負(fù)相關(guān)與無規(guī)則卷曲呈正相關(guān)。WANG等[29]也研究表明大豆分離蛋白的表面疏水性與β-折疊含量的變化呈負(fù)相關(guān)。

3 結(jié)論

采用均質(zhì)壓力(20 MPa和40 MPa)、均質(zhì)次數(shù)(1次和2次)對(duì)肌原纖維蛋白進(jìn)行改性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高壓均質(zhì)能夠改善MP的理化性和乳化性，均質(zhì)壓力為40 MPa，均質(zhì)次數(shù)為1次的處理組表現(xiàn)出較低的粒徑和較高的溶解性、乳化活性、乳化穩(wěn)定性以及電位絕對(duì)值。通過對(duì)總巰基和活性巰基的分析得出其含量隨著均質(zhì)壓力的變化而變化，表面疏水性隨著均質(zhì)壓力的增加，也表現(xiàn)出上升趨勢(shì)，紅外光譜表明均質(zhì)處理能夠改變肌原纖維蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，α-螺旋和β-折疊含量減少，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲含量增加。然而關(guān)于均質(zhì)處理過程中結(jié)構(gòu)的變化機(jī)理有待進(jìn)一步研究。