陽慧 蘇雨江 鐘江華 馬添翼

(?？谑腥嗣襻t(yī)院心血管內(nèi)科，海南 海口 570208)

心肌炎臨床癥狀包括心律失常、心源性休克、急性心功能不全等，是一種心肌炎性疾病〔1〕。自身免疫性疾病、感染、物理化學(xué)刺激等多種因素均可引起心肌炎，其中腸道病毒引起的病毒性心肌炎(VMC)較為普遍，而柯薩奇B組病毒(CVB)3是引起VMC的常見病毒〔2，3〕。目前，VMC的診斷包括心電圖、血清檢測、心臟磁共振成像、心內(nèi)膜心肌活檢等，其治療方式在支持治療的基礎(chǔ)上結(jié)合了免疫療法和抗病毒治療，為重癥VMC患者帶來了曙光〔4，5〕。但VMC在臨床診斷與治療中仍面臨挑戰(zhàn)，探索VMC發(fā)生發(fā)展機(jī)制及臨床治療靶點具有重要意義。

微小RNA(miRNA)是非編碼RNA分子，通過干擾內(nèi)源性RNA而調(diào)節(jié)多數(shù)人類基因功能，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、分化、免疫反應(yīng)等生物過程〔6〕。miRNA在人體多種病灶組織中異常表達(dá)，隨疾病程度的加深其表達(dá)水平也發(fā)生變化，是特定疾病診斷的標(biāo)志物〔7〕。研究表明〔8，9〕，miRNA分子可調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子水平，參與病毒誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。目前，關(guān)于miR-506-3p的研究相對較少，miR-506-3p與TRAF6在心肌細(xì)胞中是否存在靶向關(guān)系尚無報道，本文檢測了miR-506-3p在正常大鼠和VMC模型大鼠心臟組織中的表達(dá)及其對心肌細(xì)胞炎性因子水平、細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料 20只4周齡雄性SD大鼠(合格證號：中科動管007號)購自中國科學(xué)院上海實驗動物中心；Eagle′s液(批號：GNM-14266)購自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司；Ⅱ型膠原酶(批號：S10054)購自上海源葉生物科技有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)(批號：E1910)購自美國Promega公司；兔抗人腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TRAF)6多克隆抗體(批號：PAB12896)、兔抗人GAPDH多克隆抗體(批號：PAB1187)購自上海煊翎生物科技有限公司；胎牛血清(批號：10099-141)、DMEM培養(yǎng)基(批號：31053028)、胰蛋白酶(批號：20230)購自賽默飛世爾科技有限公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(批號：11668027)購自美國Invitrogen公司；人腫瘤壞死因子(TNF)α酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(批號：K4779)、白細(xì)胞介素(IL)-6 ELISA檢測試劑盒(批號：583361)、IL-1β ELISA檢測試劑盒(批號：583311)購自武漢艾美捷科技有限公司；TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號：RR047A)、TaKaRa實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)試劑盒(批號：RR820A)購自寶生物工程(大連)有限公司；Hoechst 33342染色劑(批號：C0030)、Trizol試劑(批號：15596)、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(批號：PC0020)、聚偏氟乙烯(PVDF)膜(批號：BSP0161)、4% 多聚甲醛(批號：P1110)、放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液(批號：R0020)購自北京Solarbio公司；MCO-18AC型CO2培養(yǎng)箱購自日本SANYO公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；NanoDrop微量核酸測定儀購自上海創(chuàng)萌生物科技有限公司；熒光顯微鏡購自上海炳宇光學(xué)儀器有限公司。

1.2動物模型制備 將20只SD大鼠隨機(jī)分為健康組、模型(VMC)組各10只。參照蔣娜等〔10〕實驗方法，將大鼠培養(yǎng)于無特定病原體環(huán)境中，給予普通飼料喂養(yǎng)。模型組大鼠腹腔注射0.1 ml含1×102TCID50 CVB3 Eagle液建立VMC模型，對照組大鼠腹腔僅注射0.1 ml不含病毒的Eagle液，所有大鼠注射頻率均為1次/d，共3 w。注射結(jié)束后處死大鼠，迅速摘取心臟并放入液氮，用于細(xì)胞分離與總RNA提取。

1.3心肌細(xì)胞分離培養(yǎng)與分組 取適量VMC組大鼠心臟組織，無菌條件下切成1 mm3左右的組織塊，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次。加入0.25%胰蛋白酶，37℃恒溫孵育20 min，離心棄上清；加入0.2%Ⅱ型膠原酶孵育4 h，120目篩過濾，PBS洗滌。含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)心肌細(xì)胞，2～3 d更換新鮮培養(yǎng)基。將對數(shù)期生長的心肌細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞融合度約50 % 時，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書分別將模擬物對照、miR-506-3p模擬物、miR-506-3p抑制劑轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞，依次標(biāo)記為對照組、miR-506-3p組、anti-miR-506-3p組，常規(guī)培養(yǎng)24 h。

1.4RT-qPCR 收集健康組、VMC組大鼠心臟組織和對照組、miR-506-3p組、anti-miR-506-3p組細(xì)胞，采用Trizol法提取總RNA，NanoDrop微量核酸測定儀檢測RNA純度和濃度。按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用TaKaRa RT-qPCR試劑盒配制反應(yīng)體系，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增。miR-506-3p引物：上游：5′-ACACTCATAAGGCACCCTTC-3′，下游：5′-TCTACTCAGAAGGGGAGTAC-3′；TRAF6引物：上游：5′-CCCAATTCCATGCACATTCAGTA-3′，下游：5′-AACAGCCTGGGCCAACATTC-3′；GAPDH引物：上游：5′-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3′，下游：5′-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3′。每個RNA樣品重復(fù)3次，采用2-△△Ct法計算miR-506-3p相對表達(dá)量。

1.5心肌TNF-α、IL-6、IL-1β含量測定 收集對照組、miR-506-3p組、anti-miR-506-3p組細(xì)胞，胰酶消化并重懸，超聲粉碎后離心取上清。分別使用試劑盒檢測。

1.6細(xì)胞凋亡檢測 收集對照組、miR-506-3p組、anti-miR-506-3p組細(xì)胞，4℃，12 000 r/min離心10 min，4%多聚甲醛固定20 min；PBS洗滌后加入Hoechst 33342染色劑，室溫孵育20 min，PBS洗滌，使用熒光顯微鏡觀察并記錄細(xì)胞凋亡情況。

1.7雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?取分離培養(yǎng)的VMC組大鼠心肌細(xì)胞，使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將TRAF6 3′-UTR野生型載體分別與模擬物對照、miR-506-3p抑制劑、模擬物抑制劑、miR-506-3p抑制劑共轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)48 h；加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，4℃，12 000 r/min離心10 min取上清，使用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。

1.8Western印跡法 取對照組、miR-506-3p組、anti-miR-506-3p組細(xì)胞，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液于冰上裂解細(xì)胞，4℃，12 000 r/min離心20 min，收集上清。取50 μg蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳結(jié)束后將蛋白樣品電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉TBST液室溫封閉1 h。分別加入兔抗人TRAF6多克隆抗體(1∶500)和兔抗人GAPDH多克隆抗體(1∶5 000)，分別加入相應(yīng)的一抗(1∶1 000)，4℃孵育過夜，洗膜后加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h，洗滌，使用電化學(xué)發(fā)光試劑盒顯示條帶，每個蛋白樣品重復(fù)3次。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-506-3p在大鼠心肌組織中的表達(dá) VMC組大鼠心臟組織中miR-506-3p相對表達(dá)水平(1.00±0.12)顯著低于健康組大鼠心臟組織(0.53±0.05，P<0.05)。

2.2miR-506-3p在心肌細(xì)胞中的表達(dá) 與對照組(1.00±0.08)相比，miR-506-3p模擬物組細(xì)胞中miR-506-3p表達(dá)(7.78±0.39)顯著上調(diào)(P<0.05)；anti-miR-506-3p組細(xì)胞中miR-506-3p表達(dá)(0.43±0.06)顯著下調(diào)(P<0.05)。

2.3miR-506-3p調(diào)節(jié)TNF-α、IL-6、IL-1β水平 與對照組比較，miR-506-3p模擬物組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平降低(P<0.05)；anti-miR-506-3p組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高(P<0.05)。見表1。

2.4miR-506-3p調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡 對比對照組〔(7.43±0.69)%〕，轉(zhuǎn)染miR-506-3p模擬物的VMC組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率〔(4.66±0.53)%〕明顯降低(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染miR-506-3p抑制劑的VMC組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率〔(17.31±1.12)%〕明顯升高(P<0.05)。

2.5TRAF6是miR-506-3p的潛在靶基因 通過Targetscan在線預(yù)測發(fā)現(xiàn)，TRAF6 3′-UTR上存在miR-506-3p的結(jié)合位點(圖1)，猜測TRAF6是miR-506-3p的潛在靶基因。進(jìn)一步使用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)TRAF6 3′-UTR野生型載體與miR-506-3p模擬物共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中熒光素酶活性(0.46±0.05)顯著降低(P<0.05)；而TRAF6 3′-UTR野生型載體與miR-506-3p抑制劑共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中熒光素酶活性(1.41±0.12)顯著增強(qiáng)(P<0.05)。

表1 miR-506-3p調(diào)節(jié)TNF-α、IL-6、IL-1β水平

與對照組比較：1)P<0.05；下表同

圖1 TRAF6 3′-UTR與miR-506-3p的互補(bǔ)序列

2.6miR-506-3p可負(fù)調(diào)控心肌炎細(xì)胞中TRAF6表達(dá) 在VMC組大鼠心肌細(xì)胞中，與對照組比較，miR-506-3p模擬物組TRAF6在mRNA和蛋白水平的表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，anti-miR-506-3p組TRAF6在mRNA和蛋白水平的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)。見圖2、表2。

圖2 各組細(xì)胞中TRAF6蛋白凝膠電泳圖

組別TRAF6 mRNATRAF6蛋白對照組1.00±0.070.52±0.04miR-506-3p模擬物組0.56±0.051)0.19±0.031)anti-miR-506-3p組3.48±0.311)0.82±0.071)

3 討 論

VMC是病毒感染引起的心肌彌漫性或局灶性疾病，目前已知其發(fā)病機(jī)制主要包括免疫反應(yīng)、氧化作用、遺傳背景、病毒直接作用4個方面〔11〕。CVB與心肌細(xì)胞表面特異受體結(jié)合，從而感染細(xì)胞；宿主識別入侵病毒而產(chǎn)生免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并刺激產(chǎn)生TNF-α、IL、轉(zhuǎn)化生長因子等大量細(xì)胞因子，促進(jìn)細(xì)胞炎性反應(yīng)〔12，13〕。TNF-α在炎性反應(yīng)中起始動作用，可誘導(dǎo)IL-1、IL-6等細(xì)胞因子，加速B細(xì)胞和T細(xì)胞增殖，提高免疫球蛋白水平，是單核巨噬細(xì)胞被活化后分泌的一種炎性細(xì)胞因子〔14〕。已有研究表明，TNF-α、IL-6、IL-1β水平的降低能夠緩解炎性反應(yīng)〔15〕。

miRNA廣泛存在于真核生物中，具有高度保守性，可通過下游靶基因調(diào)控多種疾病進(jìn)展。Rebane等〔16〕研究表明，miR-146a能夠抑制TNF-α、IL-1β等多種炎性因子表達(dá)，緩解炎性反應(yīng)。Jiang等〔17〕研究表明，miR-155在丙型肝炎病毒引起的免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)中發(fā)揮抑制作用，其機(jī)制與轉(zhuǎn)化生長因子β、IL-10有關(guān)。提示，應(yīng)深入研究miRNA在免疫應(yīng)答及炎性反應(yīng)中的作用機(jī)制，可能為miRNA在炎性疾病的診斷和治療中提供理論基礎(chǔ)。miR-506定位于X染色體，是近年來新鑒定的一種RNA分子，有報道稱，miR-506在腫瘤發(fā)展中發(fā)揮抑制作用，miR-506在多種腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，可調(diào)節(jié)多個下游靶基因，調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移和侵襲〔18，19〕。其家族成員之一的miR-506-3p已被證實在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)下調(diào)，通過抑制細(xì)胞遷移、侵襲發(fā)揮抑癌功能〔20〕。

TRAF6是TNF受體超家族和IL-1受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵銜接分子，可激活核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB等信號通路，調(diào)控胚胎發(fā)育、骨代謝、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、免疫應(yīng)答等生物學(xué)過程〔21〕。Zhu等〔22〕研究表明，TRAF6通過調(diào)節(jié)IL-1β，IL-8，IL-6，TNF-α等炎性因子水平，參與調(diào)控類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎炎性反應(yīng)；Aarts等〔23〕研究表明，抑制TRAF6后，細(xì)胞活性氧、IL-6和TNF水平降低，改善了神經(jīng)炎性反應(yīng)。

在心肌炎的相關(guān)研究〔24，25〕中，TRAF6已被證實與心肌炎性反應(yīng)有關(guān)，抑制TRAF6可減輕心肌炎的嚴(yán)重程度。本文驗證了TRAF6和miR-506-3p的靶向關(guān)系，在VMC模型大鼠心肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-506-3p模擬物，TRAF6表達(dá)下調(diào)(P<0.05)；轉(zhuǎn)染miR-506-3p抑制劑則TRAF6表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。

綜上，miR-506-3p在心肌炎組織中呈低表達(dá)，過表達(dá)miR-506-3p可減緩心肌細(xì)胞炎性反應(yīng)并抑制細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與抑制TRAF6表達(dá)從而降低促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平有關(guān)。這一研究結(jié)果為心肌炎的診斷與治療提供理論基礎(chǔ)。