張贏予 張馨木 苗軍

(1長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，吉林 長(zhǎng)春 130031；2吉林大學(xué)藥學(xué)院；3吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院藥學(xué)部)

蒽環(huán)類藥物抗腫瘤活性廣譜高效，臨床療效顯著，但其累積劑量導(dǎo)致嚴(yán)重的胃腸道反應(yīng)、脫發(fā)、骨髓抑制和心臟毒性等明顯的毒副作用。其中心臟毒性作用最常見(jiàn)最嚴(yán)重，明顯降低患者生活質(zhì)量，長(zhǎng)期應(yīng)用甚至導(dǎo)致致死性心肌損傷，顯著縮短生存期，極大程度地限制其在臨床上的應(yīng)用〔1〕。尋找相應(yīng)的治療方案對(duì)其有效抗腫瘤的同時(shí)降低誘發(fā)心臟毒性風(fēng)險(xiǎn)的意義重大。目前主要預(yù)防策略為限制其總劑量，降低累積劑量所致心臟毒性損傷；而心臟保護(hù)劑的應(yīng)用使其保證治療效果的同時(shí)最大程度保護(hù)心肌。研究表明，生脈飲(SMY)可通過(guò)多種作用機(jī)制保護(hù)心血管系統(tǒng)，有效治療心血管疾病〔2〕,能抑制蒽環(huán)類藥物多柔比星(DOX)誘導(dǎo)的心肌纖維化、調(diào)節(jié)心臟免疫微環(huán)境、抑制心臟重塑、改善心功能〔3〕。本研究觀察SMY對(duì)DOX誘導(dǎo)心肌損傷的影響并探討其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)儀器與材料 心臟彩超儀(型號(hào)：Sonos 5500，惠普公司)；熒光酶標(biāo)儀(型號(hào)：K3，賽默飛世爾公司)；透射電鏡(型號(hào)：JEM-1230，JEOL電子株式會(huì)社)。SMY北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司；DOX為Sigma-Aldrich公司；HE染色試劑盒購(gòu)自晶都生物技術(shù)有限公司；蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自生工公司；BCL-2、Bax抗體購(gòu)自CST公司；活性氧物質(zhì)(ROS)熒光測(cè)定試劑盒購(gòu)自杰美醫(yī)藥科技；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自羅氏公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 SPF級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)健康雄性Balb/c小鼠(6～8 w，20～25 g)40只，隨機(jī)分為四組(n=10)：①對(duì)照組(Control組)：生理鹽水腹腔注射同時(shí)生理鹽水灌胃；② DOX模型組(DOX組)：DOX 2 mg/kg腹腔注射，生理鹽水灌胃，給藥8 w；③DOX+SMY低劑量組(DOX+低SMY組)：建模并SMY按0.1 ml/kg每日灌胃給藥；④DOX+SMY高劑量組(DOX+高SMY組)：建模同時(shí)予SMY 0.2 ml/kg每日灌胃。

1.3心功能檢測(cè) 異氟醚麻醉小鼠，15 MHz小動(dòng)物高頻超聲探頭行心臟彩超。于乳頭肌水平移動(dòng)探頭確保對(duì)齊左室長(zhǎng)軸，采集清晰圖像，測(cè)量心臟形態(tài)，計(jì)算左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)，左室收縮末內(nèi)徑(LVESD)和左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。

1.4病理學(xué)檢測(cè) 肝素灌洗心臟組織去除血塊，10%中性甲醛過(guò)夜固定，剪至厚度2～3 mm，常規(guī)石蠟包埋切片(厚度約5 μm)、HE染色，顯微鏡下觀察病理變化。

1.5超微結(jié)構(gòu)觀察 2.5%戊二醛固定，0.1 mol/L二甲砷酸鈉緩沖液漂洗，1%鋨酸固定，再次漂洗，酒精梯度脫水，包埋、固化、切片；3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛染色；透射電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)形態(tài)。

1.6ROS含量檢測(cè) 磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗心肌組織并制成組織懸液；稀釋特異性熒光探針2′,7′-二氯熒光乙酰乙酸鹽，滴加入組織懸液，37℃孵育30 min；期間每3～5 min混勻使探針和心肌組織充分接觸，PBS洗滌除去殘余探針，熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)ROS熒光含量(激發(fā)波長(zhǎng)：488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)：525 nm)。

1.7Western印跡法檢測(cè)凋亡蛋白表達(dá) 提取心肌總蛋白Bradford法定量后，行聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，并置于含5%脫脂奶粉的TBST 緩沖液中封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，4℃過(guò)夜；TBST洗滌，Bcl-2和Bax一抗 4℃過(guò)夜，洗滌后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，室溫孵育1 h，ECL plus顯色,凝膠成像系統(tǒng)行灰度掃描并分析，計(jì)算各蛋白與內(nèi)參β-actin的比值作為相對(duì)灰度值，表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.8TUNEL法檢測(cè)心肌凋亡指數(shù) 固定、封閉、通透、TdT反應(yīng)、辣根過(guò)氧化物-鏈霉親和素反應(yīng)、二氨基聯(lián)苯胺法顯色、蘇木素復(fù)染、鹽酸酒精分化，自來(lái)水返藍(lán)；酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野，顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(判斷標(biāo)準(zhǔn)：陰性細(xì)胞即未發(fā)生凋亡的細(xì)胞，核染色為藍(lán)色；陽(yáng)性細(xì)胞即凋亡細(xì)胞，胞核染色呈深棕色或棕黃色顆粒)計(jì)算凋亡指數(shù)(AI)。AI=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1SMY改善心功能 ①與Control組相比較，DOX組(死亡1只)和DOX+低SMY組小鼠LVEF顯著下降(P<0.01，P<0.05)，LVEDD和LVESD顯著增大(均P<0.05)；DOX+高SMY組LVEF下降不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；②與DOX組相比，DOX+低SMY組LVEF升高不顯著(P>0.05)，而DOX+高SMY組LVEF顯著提高，LVEDD和LVESD顯著減小(均P<0.01)；③DOX+高SMY組較DOX+低SMY組LVEF顯著升高，LVEDD和LVESD顯著減小(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 SMY改善DOX引起的心功能障礙

與Control組比較:1)P<0.05，2)P<0.01；與DOX組比較:3)P<0.01；與DOX+低SMY組比較:4)P<0.05

2.2SMY減輕病理?yè)p傷 ①Control組心肌組織結(jié)構(gòu)正常，排列整齊紋理清晰，核染色為藍(lán)紫色；②DOX組較大部分心肌組織呈變性壞死，明顯腫脹，核消失；細(xì)胞間隙增寬、心肌纖維有較多的局限性斷裂，毛細(xì)血管充血擴(kuò)張，密度顯著增加，膠原及彈性纖維增生；淋巴細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯；③DOX+低SMY組心肌組織各部位有不同程度心肌變性、斷裂、壞死及纖維化等病理?yè)p傷，較DOX組稍有好轉(zhuǎn)；④DOX+高SMY組心肌病理改變僅局限在散在的心肌中，未見(jiàn)大范圍變性壞死，改善較DOX+低SMY組更為明顯，見(jiàn)圖1。

2.3SMY改善超微結(jié)構(gòu)改變 ①Control組心肌肌原纖維不明顯，肌漿網(wǎng)稀疏，橫小管和閏盤(pán)位于Z線水平，線粒體較為豐富，嵴排列整齊。②DOX組心肌超微結(jié)構(gòu)損傷明顯，橫管與肌質(zhì)網(wǎng)超微結(jié)構(gòu)均有不同程度的損傷，肌小節(jié)減少和結(jié)構(gòu)錯(cuò)亂，絕大部分線粒體腫脹、出現(xiàn)空泡、嵴斷裂或外膜破裂。③DOX+低SMY組超微結(jié)構(gòu)較DOX組稍有改善，但仍有較多的線粒體結(jié)構(gòu)損傷。④DOX+高SMY組心肌超結(jié)構(gòu)改善更為明顯，線粒體嵴排列整齊，見(jiàn)圖2。

圖1 SMY減輕DOX所致心肌病理?yè)p傷(HE，×200)

圖2 SMY改善DOX所致心肌超微結(jié)構(gòu)損傷(×15 000)

2.4SMY減少ROS過(guò)度累積 ①與Control組〔(321.25±14.26)熒光密度/mg pro〕相比，DOX組〔(598.72±19.43)熒光密度/mg pro〕小鼠心肌組織內(nèi)ROS熒光含量顯著升高(P<0.01)；②DOX+低SMY組〔(431.22±15.26)熒光密度/mg pro〕和DOX+高SMY組〔(339.31±12.24)熒光密度/mg pro〕較DOX組〔(598.72±19.43)熒光密度/mg pro〕ROS熒光強(qiáng)度顯著減弱(均P<0.05)。③而DOX+高SMY組〔(339.31±12.24)熒光密度/mg pro〕較DOX+低SMY組〔(431.22±15.26)熒光密度/mg pro〕ROS熒光強(qiáng)度減弱更為顯著(P<0.05)。

2.5SMY降低凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) ①促凋亡蛋白Bax表達(dá)水平比較，DOX組(0.35±0.03)較Control組(0.17±0.01)顯著升高(P<0.05)，而DOX+低SMY組(0.21±0.03)和DOX+高SMY組(0.19±0.02)與Control組(0.17±0.01)無(wú)顯著差別(均P>0.05)；DOX+低SMY組(0.21±0.03)和DOX+高SMY組(0.19±0.02)比DOX組(0.35±0.03)顯著降低(均P<0.05)。②抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)水平相比較，DOX組(0.29±0.03)較Control組(0.41±0.02)顯著降低(P<0.05)，而DOX+低SMY組(0.39±0.02)和DOX+高SMY組(0.38±0.04)與Control組(0.41±0.02)無(wú)顯著差異(均P>0.05)；DOX+低SMY組(0.39±0.02)和DOX+高SMY組(0.38±0.04)均比DOX組(0.29±0.03)顯著增高(均P<0.05)(見(jiàn)圖3)。

1～4：Control組、DOX組、DOX+低SMY組、DOX+高SMY組圖3 SMY降低凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.6SMY延緩心肌凋亡 ①DOX組〔(66.59±3.27)%〕和DOX+低SMY組〔(61.35±4.02)%〕較Control組〔(23.37±2.56)%〕AI顯著增高(均P<0.01)；DOX+高SMY組〔(26.11±2.79)%〕與Control組〔(23.37±2.56)%〕無(wú)顯著差異(P>0.05)。②DOX+低SMY組〔(61.35±4.02)%〕與 DOX組〔(66.59±3.27)%〕，AI無(wú)顯著差異(P>0.05)；DOX+高SMY組較DOX組和DOX+低SMY組AI均顯著降低(均P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 SMY緩解DOX誘導(dǎo)的心肌凋亡(DAB，×200)

3 討 論

蒽環(huán)類化療藥物在多重細(xì)胞分子機(jī)制的影響下產(chǎn)生心肌毒性損傷〔4〕，研究較多的學(xué)說(shuō)為：①超氧自由基損傷學(xué)說(shuō)：其在體內(nèi)代謝產(chǎn)生的超氧自由基導(dǎo)致心肌細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷；②鈣離子超載及能量代謝障礙學(xué)說(shuō)；③細(xì)胞凋亡學(xué)說(shuō)：通過(guò)線粒體途徑、Fas/Fas L途徑、絲裂原活化蛋白激酶途徑、P53 途徑、轉(zhuǎn)錄因子GATA-4途徑、神經(jīng)酰胺信號(hào)通路，導(dǎo)致心肌過(guò)度凋亡；④自噬學(xué)說(shuō)〔5〕。SMY治療多種心臟疾病療效確切，能有效緩解患者呼吸困難、乏力、下肢水腫等典型癥狀，減緩心室重塑，改善心功能，提高左室舒張能力〔6〕。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究顯示，SMY通過(guò)抗氧化、抑制心肌纖維化、抗凋亡、改善心肌缺血〔7,8〕等機(jī)制對(duì)心肌損傷起保護(hù)作用。

現(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明，SMY主要有效成分為人參、麥冬、五味子。人參中主要成分人參皂苷Rb1和Rg3通過(guò)抗氧化、減少鈣超載、穩(wěn)定線粒體膜電位、抑制細(xì)胞凋亡和自噬，拮抗DOX導(dǎo)致的心肌損傷，保護(hù)心血管系統(tǒng)〔9,10〕。麥冬主要成分麥冬皂苷D通過(guò)減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及緩解DOX誘導(dǎo)的自噬保護(hù)心肌〔11,12〕。五味子主要成分五味子乙素能通過(guò)MAPK/P53信號(hào)通路，抑制DNA損傷，通過(guò)抗炎抗氧化抑制DOX誘導(dǎo)的心肌功能障礙〔13〕。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果說(shuō)明，SMY能明顯緩解蒽環(huán)類藥物引起的亞細(xì)胞器病理?yè)p傷，改善心肌結(jié)構(gòu)；緩解心肌收縮力下降和心功能障礙。同時(shí)，明顯降低ROS過(guò)度累積，顯著緩解過(guò)氧化損傷。并且，降低促凋亡蛋白表達(dá)水平，增加抗凋亡蛋白的表達(dá)，減緩心肌過(guò)度凋亡，改善心功能。