王蘊(yùn)倩 薛磊 李慧聰 時(shí)軍 陳寶平

(河南大學(xué)淮河醫(yī)院 1腎內(nèi)科，河南 開封 475000；2內(nèi)分泌科)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，也是糖尿病死亡的主要原因〔1,2〕。目前糖尿病的發(fā)病率正逐年上升，DN的發(fā)生也逐漸增多〔3〕。miRNA是一種小的非編碼RNA，長度為20～25個(gè)核苷酸，通過堿基互補(bǔ)配對(duì)方式與靶基因3′UTR部分或完全互補(bǔ)，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)〔4〕。據(jù)報(bào)道，多種miRNAs的表達(dá)與DN的發(fā)生發(fā)展有關(guān)〔5〕，其中包括miR-192〔6〕、miR-377〔7〕、miR-21〔8〕。有研究報(bào)道，在冠狀動(dòng)脈〔9〕、人急性白血病〔10〕、紅斑狼瘡〔11〕等多種疾病中miR-92a-3p均出現(xiàn)異常表達(dá)。但miR-92a-3p在DN中的作用機(jī)制尚未完全清楚。G蛋白耦聯(lián)受體(GPR)124為GPR家族的孤兒受體，其與血腦屏障、血管生成關(guān)系密切〔12,13〕。孤兒受體GPR124、GPR88參與大鼠的高血壓形成〔14〕，但GPR124在DN中的調(diào)控機(jī)制尚未十分清楚。本研究擬以高糖誘導(dǎo)的小鼠損傷足細(xì)胞為研究對(duì)象，檢測(cè)miR-92a-3p、GPR124在高糖誘導(dǎo)的損傷小鼠足細(xì)胞中的表達(dá)，觀察抑制miR-92a-3p、過表達(dá)GPR124、敲減GPR124對(duì)高糖誘導(dǎo)的損傷小鼠足細(xì)胞中結(jié)蛋白(Desmin)表達(dá)和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料 永生型小鼠足細(xì)胞購自美國ATCC；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自美國GIBCO公司；LipofectamineTM2000、聚氰基丙烯酰正丁酯(BCA)蛋白定量試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連Takara公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自德國羅氏診斷有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)試劑盒、電化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光液和放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)蛋白裂解液均購自碧云天生物技術(shù)公司；脂膜蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)凋亡檢測(cè)試劑盒購自北京索萊寶公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購自美國Promega公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及模型的構(gòu)建 用含10 %胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)永生型小鼠足細(xì)胞，置于37℃,5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。按照邢玲玲〔15〕的方法建立高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞損傷模型。運(yùn)用Western印跡、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)損傷足細(xì)胞中Desmin的蛋白表達(dá)及凋亡率。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 將anti-miR-92a-3p、anti-miR-NC、pcDNA、pcDNA-GPR124、anti-miR-92a-3p+si-con、anti-miR-92a-3p+si-miR-92a-3p按照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000說明書操作步驟轉(zhuǎn)染至小鼠足細(xì)胞，然后用高糖30 mmol/L處理48 h，分別標(biāo)記為高糖+anti-miR-92a-3p組、高糖+anti-miR-NC組、高糖+pcDNA組、高糖+pcDNA-GPR124組、高糖+anti-miR-92a-3p+si-con組、高糖+anti-miR-92a-3p+si-GPR124組，轉(zhuǎn)染48 h后，用qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染成功后，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 取適量對(duì)數(shù)生長期1.3各組細(xì)胞，遵照RNA抽提試劑盒說明書要求提取RNA進(jìn)行定量，然后按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。最后按qRT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行miR-92a-3p和GPR124檢測(cè)。用2-△△Ct計(jì)算miR-92a-3p和GPR124的表達(dá)。

1.5Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn) 將1.3各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，用結(jié)合緩沖液 500 μl懸浮細(xì)胞，分別加入5 μl的 Annexin V-/ FITC和PI，混勻，室溫避光靜置15 min。采用流式細(xì)胞儀測(cè)定。細(xì)胞的凋亡率(%)=早期凋亡率+晚期凋亡率。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.6Western印跡實(shí)驗(yàn) 收集1.3各組細(xì)胞，加入裂解液，冰上裂解30 min。12 000 r/min離心10 min，取上清置于EP管，加入5×SDS上樣緩沖液，沸水煮沸10 min。電泳后用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂奶粉將膜封閉2 h，洗膜，加入Ⅰ抗，4℃過夜孵育，洗膜，加Ⅱ抗，4℃ 2 h。加發(fā)光液，曝光。

1.7雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 熒光素酶報(bào)告載體(psiCHECK2-GPR124-WT,psiCHECK2-GPR124-MUT)分別與miR-92a-3pmimics、miR-NC用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染小鼠足細(xì)胞，培養(yǎng)6 h后，更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48 h。按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明書步驟操作。結(jié)果以海參熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度與螢火蟲熒光素酶發(fā)光強(qiáng)度的比值反應(yīng)miR-92a-3p與GPR124的結(jié)合力。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1高糖刺激對(duì)小鼠足細(xì)胞損傷的影響 與對(duì)照組(0.32±0.04、6.47%±0.53%)相比，高糖組Desmin蛋白表達(dá)(0.86±0.07)顯著升高，細(xì)胞凋亡率(24.13%±1.76%)顯著升高(t=11.601、16.641，均P=0.000)。

2.2抑制miR-92a-3p對(duì)高糖刺激小鼠足細(xì)胞損傷的影響 與高糖+anti-miR-NC組相比，高糖+anti-miR-92a-3p組miR-92a-3p、Desmin蛋白表達(dá)顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見表1，圖1。

2.3敲減GPR124表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制miR-92a-3p對(duì)高糖刺激小鼠足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用 與高糖+anti-miR-92a-3p+si-NC組(0.34±0.03，9.46%±1.37%)相比，高糖+anti-miR-92a-3p+si-GPR124組Desmin蛋白表達(dá)(0.69±0.07)顯著升高，細(xì)胞凋亡率(18.49%±1.42%)顯著升高(P<0.05)，且高糖+anti-miR-NC組、高糖+anti-miR-92a-3p組、高糖+anti-miR-92a-3p+si-NC組、高糖+anti-miR-92a-3p+si-GPR124組Desmin蛋白表達(dá)、凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=46.406、61.995，均P=0.000)，見圖1。

2.4高糖刺激對(duì)小鼠足細(xì)胞中miR-92a-3p和GPR124表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，高糖組miR-92a-3p表達(dá)顯著升高，GPR124蛋白表達(dá)顯著降低(圖2)，GPR124 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見表2。

2.5GPR124過表達(dá)對(duì)高糖刺激小鼠足細(xì)胞損傷的影響 與高糖+pcDNA組相比，高糖+pcDNA-GPR124組GPR124蛋白表達(dá)顯著升高，Desmin蛋白表達(dá)顯著降低(圖3)，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見表3。

表1 抑制miR-92a-3p對(duì)高糖刺激小鼠足細(xì)胞損傷的影響

圖1 Desmin蛋白表達(dá)

圖2 GPR124蛋白表達(dá)

表2 高糖刺激對(duì)小鼠足細(xì)胞中miR-92a-3p和GPR124表達(dá)的影響

圖3 GPR124和Desmin蛋白表達(dá)

組別GPR124蛋白Desmin蛋白凋亡率(%)高糖+pcDNA組0.17±0.040.89±0.0823.76±2.06高糖+pcDNA-GPR124組0.61±0.050.41±0.0414.77±1.34t值11.9029.2956.336P值0.0000.0010.003

2.6miR-92a-3p靶向調(diào)控GPR124的表達(dá) 運(yùn)用miRcode數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)到miR-92a-3p與GPR1243′UTR存在結(jié)合位點(diǎn)(圖4)；雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，與miR-NC組(1.02±0.08、0.98±0.09)相比，miR-92a-3p組WT-GPR124細(xì)胞中熒光活性(0.43±0.04)顯著降低(t=11.425,P=0.000)，MUT-GPR124細(xì)胞中熒光活性(1.01±0.07)不受影響(t=0.456,P=0.672)；與miR-NC組(0.57±0.06)相比，miR-92a-3p組細(xì)胞中GPR124表達(dá)(0.21±0.03)顯著降低，與anti-miR-NC組(0.53±0.05)相比，anti-miR-92a-3p組(0.97±0.08)顯著升高(P<0.05),且4組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=86.925，P=0.000)。

圖4 GPR124的3′UTR中含有與miR-92a-3p互補(bǔ)的核苷酸序列

3 討 論

DN、腎小球硬化、膜性腎病均可引起足細(xì)胞疾病，足細(xì)胞的變化在此過程中具有關(guān)鍵作用〔16〕。足細(xì)胞受損導(dǎo)致其從基底膜脫落，毛細(xì)血管袢塌陷，細(xì)胞外基質(zhì)增多，最終血管袢受阻，引發(fā)腎臟疾病，因此足細(xì)胞數(shù)量的降低與DN的進(jìn)程呈正相關(guān)〔17,18〕。在建立動(dòng)物模型試驗(yàn)中，高糖是常用的經(jīng)典糖尿病誘發(fā)物。高燕等〔19〕、蘇寧等〔20〕運(yùn)用鏈脲佐菌素建立DN模型，本研究用高糖30 mmol/L處理永生型小鼠足細(xì)胞48 h建立了高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷模型，且模型構(gòu)建成功。

有研究表明，miRNA對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡具有重要作用，其可能參與人類的腎病、尿毒癥、DN等多種疾病的發(fā)生發(fā)展〔21,22〕。miR-223-3p在2型DN進(jìn)展中具有重要作用，其可作為診斷DN的新型標(biāo)志物〔23〕。詹學(xué)良等〔24〕研究報(bào)道，miR-92a的表達(dá)量與足細(xì)胞的損傷程度呈正相關(guān)，推測(cè)miR-92a可能參與腎臟細(xì)胞的損傷。楊竣〔25〕構(gòu)建了穩(wěn)定敲減miR-92a的主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，治療后可促進(jìn)糖尿病大鼠勃起，上調(diào)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)和Dickkopf相關(guān)蛋白(DKK)3的表達(dá)，揭示miR-92a-inhibition可促進(jìn)糖尿病大鼠的勃起。張成銀等〔26〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-92a的表達(dá)與DN呈正相關(guān)，提示miR-92a參與DN的發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-92a-3p高表達(dá)，且抑制miR-92a-3p可下調(diào)Desmin和細(xì)胞凋亡，保護(hù)足細(xì)胞損傷；深入研究發(fā)現(xiàn)，miR-92a-3p可靶向負(fù)調(diào)控GPR124。

GPR是一類受體超家族，其在機(jī)體的多種生理功能中具有重要作用〔27,28〕，其特征為受體結(jié)合配體后，僅能通過G蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)，再由第二信使將信號(hào)傳至效應(yīng)器〔29〕。近年研究報(bào)道GPR在DN的進(jìn)程中起關(guān)鍵作用〔30〕。GPR124為GPR家族的一種孤兒受體，其在轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β通路、β-catenin通路中均具有重要作用〔31〕。王薪寧等〔32〕報(bào)道，GPR 119、40、120均可作為抗糖尿病藥物的作用靶點(diǎn)。陸楊等〔33〕研究報(bào)道，螺內(nèi)酯可抑制DN大鼠中GPR激酶(GRK)2、GRK3、GRK4的表達(dá)，促進(jìn)GRK6、GPR17的表達(dá)，提示螺內(nèi)酯可調(diào)控DN大鼠GRKs和GPR17的表達(dá)。段倚琦〔34〕發(fā)現(xiàn)，GPR124在DN組細(xì)胞中低表達(dá)，且沉默GPR124可促進(jìn)足細(xì)胞受損，過表達(dá)GPR124可通過增強(qiáng)細(xì)胞的自噬功能發(fā)揮保護(hù)足細(xì)胞的功能。本研究發(fā)現(xiàn)，GPR124低表達(dá)，進(jìn)一步過表達(dá)GPR124發(fā)現(xiàn)，其可促進(jìn)抑制Desmin的表達(dá)，下調(diào)細(xì)胞凋亡率；深入研究發(fā)現(xiàn)，敲減GPR124表達(dá)可逆轉(zhuǎn)抑制miR-92a-3p對(duì)高糖刺激小鼠足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

綜上，miR-92a-3p可保護(hù)高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能與靶向調(diào)控GPR124有關(guān)，為糖尿病腎病的靶向治療提供新靶點(diǎn)。