楊 勇 陸 彥,2 郭淑青 石仲慧 趙 杰 范曉磊 李錢(qián)峰 劉巧泉,* 張昌泉,*

秈稻背景下導(dǎo)入Wx等位基因改良稻米食味和理化品質(zhì)

楊 勇1陸 彥1,2郭淑青1石仲慧1趙 杰1范曉磊1李錢(qián)峰1劉巧泉1,*張昌泉1,*

1揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院/ 植物功能基因組學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 江蘇省作物基因組學(xué)和分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇揚(yáng)州 225009;2揚(yáng)州大學(xué)測(cè)試中心, 江蘇揚(yáng)州 225009

水稻Wx等位基因已廣泛用于秈稻的品質(zhì)改良, 但攜帶該等位基因的一些秈稻米飯往往偏軟, 仍需進(jìn)一步改良。為明確秈稻背景下導(dǎo)入Wx等位基因?qū)Φ久资澄镀焚|(zhì)和理化品質(zhì)的效應(yīng), 分別以攜帶Wx的IR64和攜帶Wx的9311為供體, 以攜帶Wx的秈稻SIR3611 (3611)為受體, 基于分子標(biāo)記輔助選擇, 通過(guò)雜交和連續(xù)回交的方式構(gòu)建了3611背景下攜帶Wx和Wx的近等基因系。系統(tǒng)比較了不同近等基因系間的農(nóng)藝性狀以及稻米的食味和理化品質(zhì)。結(jié)果表明, 近等基因系與受體親本3611的主要農(nóng)藝性狀基本接近, 無(wú)顯著差異。NIL(Wx)稻米的表觀直鏈淀粉含量較親本3611極顯著下降而膠稠度極顯著增加。NIL(Wx)稻米表觀直鏈淀粉含量最低且與之對(duì)應(yīng)的膠稠度最高。近等基因系NIL(Wx)和NIL(Wx)稻米的食味值較親本極顯著提高。NIL(Wx)和NIL(Wx)稻米的GBSSI豐度與對(duì)應(yīng)的表觀直鏈淀粉含量具有明顯的正相關(guān)。稻米粉的黏滯性譜、熱糊化特性和晶體結(jié)構(gòu)與直鏈淀粉含量顯著相關(guān)性。本研究為在我國(guó)秈稻品種品質(zhì)改良中有效利用Wx等位基因提供了重要依據(jù)。

水稻; 食味品質(zhì);等位基因; 表觀直鏈淀粉含量; 分子標(biāo)記輔助選擇

水稻(L.)是世界上食用人口最多、種植范圍最廣的農(nóng)作物, 也是我國(guó)的主要糧食作物之一。目前我國(guó)水稻高產(chǎn)育種已經(jīng)走在了世界前列, 但是稻米品質(zhì)普遍不高, 尤其是很多秈稻品種的稻米品質(zhì)還無(wú)法達(dá)到優(yōu)質(zhì)米標(biāo)準(zhǔn)[1-2]。因此, 稻米品質(zhì)性狀的遺傳改良是當(dāng)前水稻育種研究的一個(gè)重要方向[3]。稻米的食用部分為胚乳, 其主要成分為淀粉, 包括直鏈淀粉和支鏈淀粉兩類。一般認(rèn)為, 兩類淀粉形成了淀粉的半晶體結(jié)構(gòu), 并且不同類型的比例和結(jié)構(gòu)對(duì)稻米品質(zhì)的優(yōu)劣起著重要作用[4]。其中直鏈淀粉含量是影響稻米品質(zhì)尤其是食味品質(zhì)的最主要因素, 一直被作為衡量稻米食味品質(zhì)的一個(gè)最重要指標(biāo)。通常高直鏈淀粉含量的米飯質(zhì)地較硬而低直鏈淀粉含量的米飯軟而有彈性[5-6]。由于直鏈淀粉含量難以準(zhǔn)確測(cè)定, 一般用表觀直鏈淀粉含量(apparent amylose content, AAC)來(lái)表示。盡管一些研究發(fā)現(xiàn)AAC相似的水稻品種間也存在顯著的食味品質(zhì)差異, 并且認(rèn)為這種差異主要是由支鏈淀粉的精細(xì)結(jié)構(gòu)差異造成的[7-8], 但是, 最近的一些研究表明直鏈淀粉的精細(xì)結(jié)構(gòu)對(duì)米飯的適口性影響也非常大[9]。

水稻蠟質(zhì)基因(,)是控制稻米直鏈淀粉含量的主效基因, 其編碼的顆粒結(jié)合淀粉合酶(Granule-Bound Starch Synthase I, GBSSI)直接控制直鏈淀粉的合成。研究發(fā)現(xiàn)基因的不同等位變異是稻米AAC廣泛分布的重要原因[10]。在我國(guó)非糯水稻品種中,基因主要分化為Wx和Wx兩種等位類型。其中,Wx主要分布在秈稻中, 攜帶該等位基因的稻米AAC較高, 一般在25%以上[11]。與Wx相比,Wx等位基因在第1內(nèi)含子剪接位點(diǎn)處發(fā)生了從G到T的突變, 該突變影響了前體mRNA的剪接效率, 從而降低了其編碼蛋白GBSSI的量[12]。Wx主要分布在粳稻品種中, 攜帶該等位基因的稻米AAC一般在15%~18%之間, 屬于中等或偏低水平。隨著水稻品質(zhì)性狀遺傳改良的進(jìn)步, 近些年來(lái)我國(guó)選育的一些秈稻品種(親本)如揚(yáng)稻6號(hào)(9311)、黃華占、明恢63和Y58S等都已攜有Wx等位基因, 這些秈稻品種已經(jīng)在稻米食味品質(zhì)上有了很大的提升[3], 但是對(duì)于南方地區(qū)尤其是以雜交稻米為消費(fèi)主體的省份, 由于水稻生長(zhǎng)季節(jié)的高溫等環(huán)境因素的影響, 一些以攜帶Wx等位基因?yàn)殡p親配出的雜交組合, 其稻米AAC含量偏低, 米飯偏軟, 尚需要進(jìn)一步改良以滿足消費(fèi)者的多樣化需求[13]。此外, 在秈稻中還存在一個(gè)控制中等直鏈淀粉含量的Wx等位基因, 與Wx相比, 該等位基因在第6外顯子62堿基處發(fā)生了A到C的突變, 引起了酪氨酸到絲氨酸的替換[14]。攜帶該等位基因的稻米AAC一般在18%~20%之間, 米飯軟硬適中, 食味較好, 一些優(yōu)質(zhì)秈稻如Basmati類和泰國(guó)香米等都攜帶該等位基因。但是Wx等位基因至今未在我國(guó)水稻品種選育中獲得大范圍應(yīng)用。

有關(guān)等位變異對(duì)稻米品質(zhì)的效應(yīng)研究已有很多報(bào)道[14-18], 但這些研究多采用一些品種或者染色體片段代換系, 可能會(huì)存在其他基因的干擾, 而近等基因系是研究基因等位變異效應(yīng)的理想材料。本研究以攜帶Wx等位基因的秈型雜交稻恢復(fù)系親本SIR3611 (簡(jiǎn)稱為3611)為受體親本, 以攜帶Wx和Wx等位基因的秈稻品種IR64和9311為供體, 通過(guò)雜交和連續(xù)回交, 并結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇構(gòu)建了3611背景下Wx、Wx和Wx的近等基因系。系統(tǒng)分析了不同近等基因系間的農(nóng)藝性狀和稻米理化品質(zhì)等指標(biāo), 來(lái)重點(diǎn)評(píng)價(jià)Wx等位基因在秈稻背景下對(duì)稻米品質(zhì)的改良效應(yīng)及其育種應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 供試品種與試驗(yàn)條件

用于研究的水稻材料包括秈型恢復(fù)系3611 (攜帶Wx等位基因)、秈型品種IR64 (攜帶Wx等位基因)和9311 (又名揚(yáng)稻6號(hào), 攜帶Wx等位基因)。以上材料及其來(lái)源的近等基因系正季均種植于揚(yáng)州大學(xué)文匯路校區(qū)試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng), 春季種植于海南省陵水縣試驗(yàn)基地。每個(gè)材料種植2行, 每行10株, 株行距分別為14 cm和18 cm。土壤肥力中等, 采用一般田間栽培管理技術(shù)。

1.2 近等基因系構(gòu)建

分別以9311和IR64作為供體親本(父本)與受體親本3611雜交, 雜交種F1再與3611進(jìn)行多次回交(圖1-A), 從回交BC1F1代開(kāi)始, 利用分子標(biāo)記Wxin1、Wxin2和QRM190分別對(duì)Wx和Wx近等基因系進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇(MAS)。在回交7代后再進(jìn)行自交3代。為排除遺傳背景的干擾, 利用實(shí)驗(yàn)室已有的18個(gè)淀粉合成酶基因的51個(gè)分子標(biāo)記進(jìn)行背景篩選, 參照田志喜等[19]的相關(guān)分子標(biāo)記信息。通過(guò)篩選, 獲得了Wx和Wx純合且主要淀粉合成酶基因一致的近等基因系NIL(Wxn)和NIL(Wx)。

1.3 水稻植株DNA提取和PCR分析

在水稻分蘗期, 按照單株取葉片并編號(hào), 用液氮速凍并研磨后, 采用CTAB法[20]提取總DNA用于PCR分析。在20 μL反應(yīng)液中混合1 μL總DNA (50~100 ng)、1×反應(yīng)緩沖液(含鎂離子和dNTPs)、1 μmol L–1引物和1 UDNA聚合酶(諾唯贊)及適量水, 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。根據(jù)Wx和Wx等位基因第1外顯子區(qū)CT重復(fù)序列, 設(shè)計(jì)能夠區(qū)分Wx和Wx的特異性引物QRM190-F (5′-ATTCCTTCAGTTCTTTGT CTATCTC-3′)與QRM190-R (5′-TCCTGATGAACAA CAGAACAACAC-3′)。根據(jù)Wx和Wx在第6外顯子A/C的變異, 設(shè)計(jì)四引物擴(kuò)增受阻突變(tetra- primer ARMS-PCR)引物對(duì)Wxin1-F (5′-AACAACC CATACTTCAAAGGAACATC-3′)和Wxin1-R (5′-GT AGATGCCATTGGGCTGGTAGT-3′)、以及引物對(duì)Wxin2-F (5′-GCTTAGCTTCCACTGGTGATTTCA-3′)和Wxin2-R (5′-TCTTGAGATCAATTGTAACTCCC CAT-3′)。QRM190分子標(biāo)記的PCR條件為95℃, 5 min, 95℃, 50 s, 53℃, 30 s, 72℃, 20 s, 35個(gè)循環(huán); 72℃, 10 min。Wxin分子標(biāo)記的PCR反應(yīng)條件為95℃, 5 min, 95℃, 50 s, 53℃, 30 s, 72℃, 35 s, 35個(gè)循環(huán); 72℃, 10 min。PCR產(chǎn)物在3.0%的瓊脂糖凝膠電泳上分離, 然后在Bio-RAD UV 1000核酸成像儀上觀察。

1.4 田間農(nóng)藝性狀測(cè)定

水稻成熟時(shí), 選取每個(gè)系中間10個(gè)單株, 測(cè)量株高和有效穗數(shù)。隨后, 選取每株一個(gè)主穗, 統(tǒng)計(jì)穗長(zhǎng)、結(jié)實(shí)率和千粒重。

圖1 近等基因系構(gòu)建過(guò)程(A)與近等基因系糙米表型(B)

MAS: 分子標(biāo)記輔助選擇; NIL: 近等基因系。

MAS: molecular marker-assisted selection; NIL: near-isogenic line.

1.5 稻米樣品前處理

收獲的成熟稻谷經(jīng)40℃烘干后用礱谷機(jī)出糙獲得糙米, 去除發(fā)霉變質(zhì)及未成熟米粒后用精米機(jī)(日本Kett公司)處理得精米。利用旋風(fēng)式磨粉機(jī)(丹麥FOSS公司)將精米磨成粉, 并過(guò)100目篩, 放入40℃烘箱中烘2 d, 在室溫下平衡2 d后裝于自封袋密封, 于4℃存放備用。

1.6 蛋白SDS-PAGE分析

準(zhǔn)確稱取100 mg米粉, 加入1.5 mL抽提緩沖液[Tris-HCl (pH 6.8) 0.05 mol L–1, SDS 2.8%, 甘油10%, 2-ME 5%], 放于搖床上, 37℃抽提30 min, 10,000×離心, 吸取上清液, 獲得總蛋白抽提物(含有游離態(tài)GBSSI), 放于4℃?zhèn)溆?。剩余沉? 用相同抽提液抽提3次, 每次30 min, 離心, 去掉上清液。沉淀再次加入500μL抽提緩沖液, 混勻后高溫煮沸5 min, 冷卻至室溫后再加入500μL抽提緩沖液, 10,000×離心10 min, 吸取上清液到新的離心管中, 獲得淀粉粒結(jié)合GBSSI。對(duì)上述總蛋白和淀粉粒結(jié)合GBSSI參照Liu[21]的方法進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.7 稻米理化品質(zhì)測(cè)定

采用萬(wàn)深公司大米外觀品質(zhì)檢測(cè)儀(SC-E)測(cè)定稻米外觀品質(zhì); 采用STA1A食味儀(日本佐竹公司)測(cè)定米飯食味值; 參照農(nóng)業(yè)部頒布的標(biāo)準(zhǔn)《NY147- 88米質(zhì)測(cè)定方法》測(cè)定稻米AAC及膠稠度(Gel consistency, GC); 稻米粉黏滯性(RVA)的測(cè)定參照Z(yǔ)hang等[22]的方法; 利用差示掃描量熱儀(DSC) (德國(guó)耐馳公司, DSC 200 F3型號(hào))測(cè)量米粉的熱力學(xué)特性[22]; 參照Z(yǔ)hang等[22]的方法, 分別利用多晶X-射線衍射儀(德國(guó)布魯克AXS公司, D8-ADVANCE)和傅里葉紅外光譜分析(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)測(cè)定米粉的晶體結(jié)構(gòu)。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)樣品測(cè)定至少作2次重復(fù), 利用Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)收集, 用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 15.0進(jìn)行方差分析。實(shí)驗(yàn)中所有的數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 近等基因系的構(gòu)建及其田間表現(xiàn)

如圖2-A所示, QRM190能夠很好的對(duì)Wx和Wx進(jìn)行區(qū)分。如圖2-B所示, 分子標(biāo)記Wxin1和Wxin2能夠很好地區(qū)分Wx和非Wx基因型。通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇, 回交系繼續(xù)與輪回親本3611回交7代并自交3代, 獲得了BC7F3群體。通過(guò)篩選, 獲得了3611背景下Wx和Wx基因型純合且其他18個(gè)淀粉合成酶基因型與受體親本一致的近等基因系NIL(Wx)和NIL(Wx) (圖1-A)。

在選育獲得純合近等基因系后, 首先比較了近等基因系與受體親本的主要農(nóng)藝性狀, 如表1和圖1-B所示, 2個(gè)近等基因系在株高、穗長(zhǎng)、結(jié)實(shí)率、千粒重和粒形等方面與受體親本3611相比均沒(méi)有顯著差異。這些結(jié)果表明, 在田間正常種植條件下兩個(gè)近等基因系主要農(nóng)藝性狀與受體親本一致, 可以用于后續(xù)等位基因的效應(yīng)分析。

2.2 不同近等基因系稻米中GBSS I表達(dá)量的比較

為進(jìn)一步確認(rèn)不同等位基因在相同背景下編碼的蛋白豐度的差異, 分析了3個(gè)近等基因系稻米中GBSSI的積累情況。如圖3-A所示, 在其他蛋白總量一致的情況下, 3個(gè)樣品米粉中可溶性GBSSI蛋白的差異顯著, 攜帶Wx的稻米米粉中游離態(tài)GBSSI含量最高, 其次為NIL(Wx)樣品, 而NIL (Wx)米粉中的游離態(tài)GBSSI水平最低。進(jìn)一步分析GBSSI的量(圖3-B)表明,Wx米粉中結(jié)合態(tài)GBSSI量仍然最多, 其次是Wx米粉, 最少的是Wx米粉。這些結(jié)果與各近等基因系稻米的AAC具有明顯的正相關(guān)(表2), 也與已有的報(bào)道較為一致[23]。

圖2 不同Wx等位基因特異分子標(biāo)記的檢測(cè)

A圖為利用QRM190分子標(biāo)記區(qū)分Wx和Wx的PCR檢測(cè)結(jié)果, 泳道1為3611, 2為9311, 3~7為近等基因系NIL(Wx); B圖為利用基因特異分子標(biāo)記區(qū)分Wx和Wx的PCR檢測(cè)結(jié)果, 泳道1為3611, 2為IR64, 3~7為近等基因系NIL(Wx)。

(A): allelic specific molecular marker QRM190 for detectingWxandWx. Lanes 1–7: 3611, 9311 and their derived NIL NIL(Wx) (lanes 3–7), respectively. (B): allelic specific molecular marker for detectingWxandWx. Lanes 1–7: 3611, IR64 and their derived NIL NIL(Wx) (lanes 3–7), respectively.

表1 近等基因系主要農(nóng)藝性狀表現(xiàn)

同列標(biāo)以不同小寫(xiě)字母的值差異極顯著(< 0.01),= 10。

Values within the same column followed by different letters are significant different at< 0.01 and= 10.

圖3 近等基因系成熟種子中GBSS I蛋白游離態(tài)(A)和結(jié)合態(tài)(B)的SDS-PAGE分析

M: 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1~2: 3611(Wx); 3~4: NIL(Wx); 5~6: NIL(Wx); 箭頭所示為60 kD的GBSSI蛋白。

Lane M: the protein standard molecular mass; Lanes 1–2: 3611(Wx); Lane 3–4: NIL(Wx); Lanes 5–6: NIL(Wx); The arrows indicate the 60 kD GBSSI.

2.3 不同近等基因系稻米理化品質(zhì)的比較

如表2所示, 3611(Wx)成熟稻米的表觀直鏈淀粉含量最高, 近等基因系NIL(Wx)稻米的AAC處于中間水平, 而NIL(b)稻米AAC較低。這些結(jié)果與上述的SDS-PAGE分析具有非常好的一致性, 說(shuō)明AAC的水平與GBSSI豐度具有直接的正相關(guān)性。3611(Wx)稻米的膠稠度最硬, 而NIL(Wx)稻米的膠稠度極顯著變軟, 與NIL(Wx)較為接近, 說(shuō)明Wx等位基因能夠顯著改善秈米的米飯質(zhì)地, 使其變軟。該結(jié)果與AAC的水平也表現(xiàn)出非常好的負(fù)相關(guān)性。進(jìn)一步比較米飯的食味值發(fā)現(xiàn), 3611(Wx)稻米的食味值最低, 其次是NIL(Wx), 而NIL(Wx)的食味值最高。考慮到米飯食味值采用的是黑龍江粳稻打分模式, 可能會(huì)對(duì)秈稻的分析造成一定影響, 結(jié)合膠稠度結(jié)果來(lái)看, NIL(Wx)稻米的實(shí)際食味表現(xiàn)可能會(huì)更好, 甚至優(yōu)于NIL(Wx)稻米。此外, 近等基因系NIL(Wx)和NIL(Wx)的稻米堊白粒率較親本對(duì)照均極顯著下降, 稻米堊白度在2個(gè)近等基因系中也極顯著下降, 說(shuō)明在雜交和回交過(guò)程中3611的外觀品質(zhì)也得到了改良。

表2 不同近等基因系稻米理化和外觀品質(zhì)

同列標(biāo)以不同小寫(xiě)字母的值差異極顯著(< 0.01),= 3。

Values within the same column followed by different letters are significant different at< 0.01 and= 3.

2.4 不同近等基因系稻米黏滯性的比較

稻米黏滯性是反映稻米食味品質(zhì)的另一重要指標(biāo), 稻米黏滯性測(cè)定能夠模擬稻米蒸煮過(guò)程的動(dòng)態(tài)變化, 相關(guān)指標(biāo)能貼切反映米飯的口感和質(zhì)地[24]。因此, 我們測(cè)定了不同近等基因系米粉的RVA譜。如圖4所示, 近等基因系NIL(Wx) RVA譜的峰值黏度最高, 而NIL(Wx)和3611(Wx)的峰值黏度較為接近。此外, 3611(Wx)米粉的冷膠黏度最高, 說(shuō)明其蒸煮后的米飯冷卻后較硬, 這與膠稠度測(cè)定結(jié)果具有很好的一致性, 也與其米飯食味值測(cè)定結(jié)果相符, 這進(jìn)一步說(shuō)明RVA譜的冷膠黏度越大, 對(duì)應(yīng)稻米的食味品質(zhì)可能越差[4]。已有的研究發(fā)現(xiàn)食味品質(zhì)好的稻米一般具有較大的崩解值和較小的消堿值[24]。通過(guò)對(duì)表3中RVA譜的特征值分析, 發(fā)現(xiàn)與親本3611(Wx)相比, NIL(Wx)和NIL(Wx)稻米的崩解值顯著提高, 而冷膠黏度和消減值顯著下降, 尤其是NIL(Wx)稻米的崩解值最大而消減值最小。這些結(jié)果說(shuō)明在3611背景中導(dǎo)入Wx或Wx等位基因后, 其稻米食味品質(zhì)得到了顯著改良。

2.5 不同近等基因系稻米糊化特性的比較

稻米糊化溫度也是評(píng)價(jià)稻米食味品質(zhì)的重要指標(biāo)。研究表明,基因是控制糊化溫度的主效基因且與基因連鎖[15]。我們?cè)诮然驑?gòu)建過(guò)程中, 已經(jīng)根據(jù)分子標(biāo)記篩選了可能與等位基因連鎖導(dǎo)入的等位基因, 排除了由基因帶來(lái)的可能干擾。為進(jìn)一步明確不同等位基因?qū)Φ久缀瘻囟鹊挠绊? 利用差式量熱掃米儀(DSC)分析了不同稻米樣品的熱糊化特性。如圖5所示, 盡管3個(gè)樣品的吸熱曲線比較相似, 但是親本3611(Wx)稻米的吸熱峰較為提前, 表現(xiàn)為起始糊化溫度較低。通過(guò)熱糊化參數(shù)分析(表4)可以看出, 與親本3611(Wx)相比, 近等基因系NIL(Wx)和NIL(Wx)米粉的起始糊化溫度、峰值糊化溫度和終止糊化溫度都顯著提高, 其中NIL(Wx)的糊化溫度最高。此外, 從吸收的熱量來(lái)看, NIL(Wx)稻米的熱焓值也最高, 而3611(Wx)稻米最低。這些結(jié)果表明不同等位基因的差異也能造成稻米糊化特性的顯著改變。這與我們前期的研究結(jié)果也較為一致[25]。

表3 不同近等基因系稻米R(shí)VA特征值

同列標(biāo)以不同小寫(xiě)字母的值差異極顯著(< 0.01),= 2。

Values within the same column followed by different letters are significant different at< 0.01 and= 2.

圖4 不同近等基因系稻米粉RVA譜分析

圖5 不同近等基因系米粉的DSC分析

表4 不同近等基因系稻米米粉熱糊化參數(shù)

同列標(biāo)以不同小寫(xiě)字母間差異極顯著(< 0.01),= 3。

Values within the same column followed by different letters are significant different at< 0.01 and= 3.

2.6 不同近等基因系稻米晶體結(jié)構(gòu)的比較

稻米淀粉是由直鏈淀粉和支鏈淀粉形成的半晶體復(fù)合物, 其理化特性與淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。我們首先利用X射線衍射儀(XRD)分析了3個(gè)近等基因系米粉樣品的晶體衍射情況。如圖6-A所示, 3個(gè)樣品在衍射角15°、17°、18°和23°附近有較強(qiáng)的衍射峰, 屬于谷物淀粉中典型的A類型晶體結(jié)構(gòu)[26]。從衍射曲線來(lái)看, 不同近等基因系樣品間無(wú)顯著差異, 但是通過(guò)結(jié)晶度計(jì)算, 發(fā)現(xiàn)不同樣品間結(jié)晶度差異都極顯著。如表5所示, NIL(Wx)樣品的結(jié)晶度最高, 其次是NIL(Wx), 親本3611(Wx)樣品結(jié)晶度最低。研究表明結(jié)晶度越高, 在吸熱反應(yīng)中所需的熱量就越多[27], 該結(jié)果能夠很好地解釋NIL(Wx)的熱焓值最高而3611(Wx)最低。

圖6 不同近等基因系米粉的X射線衍射(A)和紅外光譜分析(B)

傅里葉變換紅外光譜技術(shù)(FTIR)能夠用于精確分析淀粉晶體結(jié)構(gòu)中的短程有序結(jié)構(gòu)[26]。通過(guò)計(jì)算特定波長(zhǎng)的吸收強(qiáng)度比值(1045/1022 cm–1), 可以分析淀粉分子的短程有序程度, 一般認(rèn)為其比值越大, 短程有序度越高[28]。因此, 利用該技術(shù)對(duì)不同近等基因系樣品進(jìn)行了分析。如圖6-B所示, 3個(gè)樣品的紅外吸收曲線較為一致, 但是通過(guò)參數(shù)計(jì)算(1045/ 1022 cm–1), 發(fā)現(xiàn)NIL(Wx)樣品的短程有序程度最高, 其次是NIL(Wx), 而最低的是受體親本(表5)。這與XRD的分析結(jié)果完全一致, 也與我們前期通過(guò)修飾GBSSI活性而創(chuàng)建的具有不同AAC稻米淀粉的晶體結(jié)構(gòu)分析相符合[25]。

3 討論

隨著生活水平的提高, 消費(fèi)者對(duì)于稻米品質(zhì)的要求越來(lái)越高, 尤其關(guān)心稻米的食味品質(zhì)。通常認(rèn)為, 直鏈淀粉含量對(duì)于稻米食味品質(zhì)的影響最大。因此, 在近些年來(lái)的稻米品質(zhì)改良研究中已廣泛開(kāi)展了等基因的分子標(biāo)記輔助選擇利用[3,29]。我國(guó)目前大部分秈稻產(chǎn)區(qū)一般通過(guò)引入Wx等位基因來(lái)改良秈稻的食味品質(zhì)。但是東南亞一帶的優(yōu)質(zhì)秈稻一般攜帶Wx, 說(shuō)明該等位基因在秈稻食味品質(zhì)改良中可能更有效[30-32]。為系統(tǒng)比較Wx、Wx和Wx在秈稻背景下對(duì)稻米品質(zhì)的影響, 本研究構(gòu)建了秈稻3611(Wx)背景下Wx和Wx的近等基因系, 分析了Wx等位基因在秈稻背景下對(duì)稻米食味品質(zhì)的改良效應(yīng)和不同等位基因?qū)Φ久灼渌砘匦缘挠绊憽?/p>

表5 不同近等基因系米粉的X射線衍射和傅里葉變換紅外光譜參數(shù)

同列標(biāo)以不同小寫(xiě)字母間差異極顯著(< 0.01),= 3。

Values with in the same column followed by different letters are significant different at< 0.01 and= 3.

近年來(lái)有關(guān)基因的等位變異及其對(duì)稻米品質(zhì)的效應(yīng)研究已有很多, 如通過(guò)不同品種間的關(guān)聯(lián)分析, 發(fā)現(xiàn)基因和基因是稻米蒸煮與食味品質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的主效基因[5,15,32]。此外, 基于等位變異和、和的互作研究, 發(fā)現(xiàn)不同等位基因類型能夠協(xié)同、和調(diào)控稻米的理化品質(zhì), 如Wx等位基因是控制高抗性淀粉的必要條件[33-35]。在品質(zhì)性狀全基因組關(guān)聯(lián)分析研究方面, 發(fā)現(xiàn)基因的不同等位變異位點(diǎn)與稻米品質(zhì)的理化指標(biāo)關(guān)聯(lián)密切[36-37]。為排除遺傳背景干擾, Teng等[38-39]通過(guò)染色體片段代換系分析了5個(gè)自然等位變異基因的效應(yīng), 發(fā)現(xiàn)GBSSI活性水平與AAC及其他理化指標(biāo)存在明顯的相關(guān)性。本研究盡管沒(méi)有進(jìn)行GBSSI的活性測(cè)定, 但是對(duì)GBSSI的豐度包括游離態(tài)和淀粉粒結(jié)合態(tài)的GBSSI豐度進(jìn)行了分析, 說(shuō)明不同等位基因所編碼的GBSSI豐度無(wú)論是游離態(tài)還是淀粉粒結(jié)合態(tài)都存在顯著差異, 并且與AAC呈現(xiàn)出明顯的正相關(guān)性。我們進(jìn)一步分析了不同近等基因系稻米的晶體結(jié)構(gòu), 發(fā)現(xiàn)AAC與稻米晶體結(jié)構(gòu)存在直接的負(fù)相關(guān)性, 即AAC越高, 結(jié)晶度越低, 而結(jié)晶度又與稻米的熱焓值正相關(guān), 即較高的結(jié)晶度需要較高的熱量去熔解。這些結(jié)果不僅符合之前一些有關(guān)淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)與稻理化指標(biāo)的相關(guān)性結(jié)果[25,39], 而且更加明確了這種相關(guān)性。

截至目前, 在水稻中至少發(fā)現(xiàn)了8個(gè)基因的等位變異類型[2], 在非糯栽培稻中廣泛分布的主要為Wx、Wx和Wx。其中Wx主要存在于我國(guó)傳統(tǒng)的秈稻品種中, 而Wx主要存在于粳稻品種中。Wx等位基因目前在國(guó)內(nèi)栽培水稻中分布非常稀少, 而在東南亞以及美國(guó)等地區(qū)的熱帶粳稻和部分秈稻中廣泛存在[30-31]。由于水稻品質(zhì)遺傳改良的發(fā)展, 我國(guó)目前很多秈稻品種中已經(jīng)通過(guò)導(dǎo)入Wx等位基因來(lái)進(jìn)行稻米品質(zhì)改良[3], 但其AAC水平在秈稻中偏低, 尤其是南方夏季高溫稻區(qū)很難達(dá)到優(yōu)質(zhì)米的標(biāo)準(zhǔn)。本研究表明, 較Wx而言, 導(dǎo)入Wx等位基因的稻米具有稍高的AAC, 稍硬的膠稠度和適中的糊化溫度, 其可能在食味品質(zhì)改良方面較Wx等位基因具有更大的潛力。近些年來(lái)的研究表明, 除了遺傳因素, 環(huán)境條件也是影響稻米食味品質(zhì)的眾多因素之一[40-41]。其中, 水稻灌漿結(jié)實(shí)期的高溫環(huán)境是降低稻米食味品質(zhì)的重要因素, 高溫一方面能造成外觀品質(zhì)變差, 另一方面也能導(dǎo)致AAC下降[13,25]。因此, 盡管通過(guò)在秈稻中引入Wx等位基因能夠提高稻米的食味品質(zhì), 但在南方高溫高濕的環(huán)境下會(huì)造成其品質(zhì)表現(xiàn)不穩(wěn)定, 高溫年份品質(zhì)容易變差[41-42]。Teng等對(duì)秈稻背景下攜帶不同等位基因的染色體片段代換系的分時(shí)播期試驗(yàn), 證明攜帶Wx等位基因的稻米品質(zhì)對(duì)環(huán)境改變更敏感[38]。目前雜交秈稻也多通過(guò)引入Wx等位基因進(jìn)行品質(zhì)改良, 但我國(guó)南方地區(qū)的雜交秈稻抽穗灌漿期多位于高溫頻發(fā)季節(jié), 而Wx相對(duì)Wx對(duì)高溫更敏感[43], 因此, 攜帶Wx的雜交稻米AAC會(huì)偏低, 米飯對(duì)于南方消費(fèi)者而言偏軟。而Wx等位基因可能更適合南方地區(qū)的消費(fèi)者。Wang等利用攜帶Wx、Wx和Wx等位基因的17份親本材料, 配制了136個(gè)雜交組合, 證明Wx/Wx和Wx/Wx組合類型的雜交稻米AAC較為適中[44], 這進(jìn)一步說(shuō)明Wx等位基因在我國(guó)秈稻尤其是雜交秈稻品質(zhì)改良方面可能更有效。

4 結(jié)論

在當(dāng)下栽培稻中廣泛分布的Wx、Wx和Wx等位基因?qū)Φ久资澄镀焚|(zhì)的效應(yīng)已經(jīng)非常明確,Wx和Wx等位基因的引入能夠顯著改善秈稻米飯的食味品質(zhì), 其中Wx在秈稻中由于能夠適度提高AAC和改良米飯質(zhì)地, 可能是今后秈稻尤其是雜交秈稻品質(zhì)改良重點(diǎn)關(guān)注的等位基因。通過(guò)Wx/Wx或者Wx/Wx組合來(lái)嘗試雜交稻米品質(zhì)改良可能是一個(gè)重要的研究方向。在稻米品質(zhì)改良生產(chǎn)實(shí)踐中, 由于地域和文化的差異, 可能需要在考慮當(dāng)?shù)叵M(fèi)者對(duì)米飯食味偏好性的基礎(chǔ)上, 有針對(duì)性地引入多樣化的等位基因, 搭配出具有不同食味品質(zhì)的組合以滿足不同人群的需求。

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Improvement of rice eating quality and physicochemical properties by introgression ofWxallele invarieties

YANG Yong1, LU Yan1,2, GUO Shu-Qing1, SHI Zhong-Hui1, ZHAO Jie1, FAN Xiao-Lei1, LI Qian-Feng1, LIU Qiao-Quan1,*, and ZHANG Chang-Quan1,*

1Jiangsu Key Laboratory for Crop Genomics and Molecular Breeding / Key Laboratory of Plant Functional Genomics of Ministry of Education / Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops, Agricultural College of Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu, China;2Instrumental Analysis Center, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu, China

Nowadays, theWxallele has been widely used to improve grain quality ofrice. However, somevarieties carryingWxallele usually has a much softer texture, which is not favored by consumers in South China. So the grain quality of these varieties needs to be further improved. To understand the effect ofWxallele on rice eating quality and physicochemical properties inrice, we developed two Near-Isogenic Lines (NILs) carryingWxandWxalleles by crossing anvariety 3611 (receptor, carryingWx) with IR64 (carryingWx) and 9311 (carryingWx), and seven times of backcrossing based on molecular marker assistant selection (MAS). Theeffects in controlling the synthesis of amylose, grain quality, and physicochemical properties were investigated. There were non-significant differences in the agronomic traits among the NILs. However, for grain quality characters, we found that the NIL(Wx) rice showed significantly lower apparent amylose content (AAC) and higher gel consistency (GC), compared with the wild type 3611. Besides, the NIL(Wx) rice showed the lowest AAC and highest GC among three lines. The NIL(Wx) rice had a significantly higher taste value than the wild type 3611, while the NIL(Wx) rice exhibited the highest taste value among the three samples. The granule-bound starch synthase I (GBSSI) level was the highest in 3611, moderate in NIL(Wx) and lowest in NIL(Wx), which showed a positive correlation with the AAC level. Also, the starch viscosity, thermal gelatinization property and crystal structure of different rice flours had a high correlation with the AAC level. To sum up, our results proved that bothWxandWxallele can improve the grain quality in 3611 background, and what is more, theWxallele might be more useful for the improvement of grain quality inrice.

L.; eating quality;allele; apparent amylose content; molecular marker assisted selection

本研究由國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFD0100501), 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31872860,31561143008), 江蘇省科技計(jì)劃項(xiàng)目(BE2018357, BK20160464), 江蘇省高等學(xué)校自然科學(xué)研究項(xiàng)目(16KJB210011), 雜交水稻國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(湖南雜交水稻研究中心)開(kāi)放課題(2018KF04)和揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)專業(yè)本科生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2016YFD0100501), the National Natural Science Foundation of China (31872860,31561143008), the Government of Jiangsu Province (BE2018357,BK20160464), the Natural Science Foundation of the Jiangsu Higher Education Institutions of China (16KJB210011), the Open Research Fund of State Key Laboratory of Hybrid Rice (Hunan Hybrid Rice Research Center), and the Personnel Training Program for Undergraduates in Agricultural College of Yangzhou University.

劉巧泉, E-mail: qqliu@yzu.edu.cn; 張昌泉, E-mail: cqzhang@yzu.edu.cn

E-mail:1046354026@qq.com

2018-12-14;

2019-06-20;

2019-07-15.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190712.1548.006.html

10.3724/SP.J.1006.2019.82064