王曉娟 潘振遠(yuǎn) 劉 敏 劉忠祥 周玉乾 何海軍 邱法展,*

一個(gè)新的玉米基因等位突變體的遺傳分析與分子鑒定

王曉娟1,**潘振遠(yuǎn)2,**劉 敏2劉忠祥1周玉乾1何海軍1邱法展2,*

1甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所, 甘肅蘭州 730070;2華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖北武漢 430070

前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)一個(gè)玉米雄性不育突變體(), 命名為。經(jīng)過(guò)連續(xù)多代雜合單株自交發(fā)現(xiàn)該突變體性狀能穩(wěn)定遺傳, 遺傳模式分析表明該突變體為單個(gè)隱性1核基因控制。以與自交系B73 雜交構(gòu)建F2遺傳定位群體, 利用BSA (Bulk Segregant Analysis)方法, 篩選到與位點(diǎn)連鎖的4個(gè)SSR標(biāo)記, 即C6-24、C6-30、C6-34和C6-40。進(jìn)一步采用444個(gè)F2單株對(duì)這4個(gè)連鎖標(biāo)記驗(yàn)證, 將定位于標(biāo)記C6-24與C6-34之間, 即玉米第6染色體68.5~98.1 Mb之間。通過(guò)基因組序列信息分析發(fā)現(xiàn), 在此定位區(qū)間內(nèi)存在一個(gè)已報(bào)道的基因。基因編碼MADS-BOX蛋白, 是參與花器官建成ABCD模型的B功能基因, 該基因的突變會(huì)造成雄花不育、雌花花絲增多等表型。利用雜合體+/與純合突變體/雜交進(jìn)行等位測(cè)驗(yàn), 雜交后代中正常植株與突變植株分離比例符合1∶1。基因組序列以及轉(zhuǎn)錄本序列分析發(fā)現(xiàn),突變體中第6個(gè)內(nèi)含子5'端供體位點(diǎn)AG/GTAAG (外顯子/內(nèi)含子交接處)的序列+1位G突變?yōu)镃, 導(dǎo)致第6外顯子被錯(cuò)誤剪切掉, 產(chǎn)生了第6個(gè)外顯子缺失的異常轉(zhuǎn)錄本。以上實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明,與所報(bào)道的由mutator轉(zhuǎn)座子插入造成的突變體、-和的突變方式不同, 是一個(gè)新的基因等位突變體。的發(fā)現(xiàn)與鑒定為進(jìn)一步深入解析玉米穗花器官?zèng)Q定的遺傳機(jī)制提供豐富的實(shí)驗(yàn)材料, 同時(shí)也為RNA加工過(guò)程中剪接位點(diǎn)保守性提供重要證據(jù)。

玉米; 雄性不育; 遺傳分析;; 基因定位; 等位突變

植物典型的花器官的構(gòu)造分為4層,由外而內(nèi)依次為花萼、花瓣、雄蕊以及雌蕊, 而每一層花器官都是由不同的基因所控制的, 因此前人提出了經(jīng)典的花器官發(fā)育的ABCE模型來(lái)解釋決定花器官的遺傳機(jī)制[1-2]。依據(jù)這個(gè)模型, A類(lèi)基因單獨(dú)地決定著花萼的形成, A和B兩類(lèi)基因一起決定著花瓣的形成, B和C這兩類(lèi)基因一起決定著雄蕊的形成, C類(lèi)基因單獨(dú)決定著雌蕊的形成, 而E類(lèi)基因在上述4層花器官的建成中都起著重要的作用[2-4]。是玉米中第一個(gè)被分離到的B功能基因, 它的克隆是人們對(duì)玉米B功能基因認(rèn)識(shí)的一次飛躍[5]。是一個(gè)B功能DEF/AP3類(lèi)同源基因, 原位雜交分析顯示首先在內(nèi)/外稃原基被激活表達(dá), 隨后在漿片原基和雄蕊原基中表達(dá), 并在它們的整個(gè)發(fā)育過(guò)程中都表達(dá)?；虻耐蛔?cè)斐尚刍ú挥? 漿片以及花藥退化為膜狀結(jié)構(gòu), 并在末端形成了絲狀突出物; 雌花可育, 花絲增多[6]。

真核生物的基因組包含大量的不能被翻譯成蛋白質(zhì)的非編碼序列。前體RNA中就含有大量的內(nèi)含子, 這些內(nèi)含子必須經(jīng)過(guò)剪切才能形成成熟mRNA, 以進(jìn)行下一步的翻譯和調(diào)控。在前體RNA的剪切過(guò)程中, 內(nèi)含子通過(guò)2個(gè)外顯子的連接而被精確切除, 剪切過(guò)程是由剪切體(spliceosome)介導(dǎo)的。前體RNA的剪切需要兩步轉(zhuǎn)酯反應(yīng), 第一步是靠近內(nèi)含子3￠端分支點(diǎn)的A殘基的2’-OH對(duì)5￠端的磷酸基團(tuán)進(jìn)行親核攻擊, 形成2’-5￠磷酸二酯鍵連接的套環(huán)結(jié)構(gòu); 接著發(fā)生第2步轉(zhuǎn)酯反應(yīng), 被剪接的外顯子3￠核苷酸的-OH進(jìn)攻3’內(nèi)含子末端的磷酸基團(tuán), 最后在3￠內(nèi)含子外顯子剪接點(diǎn)處斷開(kāi), 套索結(jié)構(gòu)釋放, 2個(gè)外顯子連接[7-10]。在整個(gè)剪接過(guò)程中, 剪接位點(diǎn)起著關(guān)鍵的作用, 并且研究發(fā)現(xiàn), 內(nèi)含子/外顯子剪接位點(diǎn)的序列也是相當(dāng)保守的。剪接位點(diǎn)的變異很可能造成轉(zhuǎn)錄本外顯子的丟失或者一些隱藏的剪接位點(diǎn)的激活, 從而產(chǎn)生異常的轉(zhuǎn)錄本[11]。內(nèi)含子5￠端供體位點(diǎn)AG/ GTAAG (外顯子/內(nèi)含子交接處)的序列非常保守, 位于內(nèi)含子的5個(gè)堿基與U1 RNA的互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合是RNA剪接的首要條件[12-13]。前2個(gè)堿基GT是最為保守的, 這2個(gè)堿基的突變通常會(huì)造成錯(cuò)誤的剪接。雖然+5處的堿基G也是相當(dāng)保守的, 但只有20%的突變會(huì)造成錯(cuò)誤的剪接發(fā)生[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)玉米雄性不育突變體材料, 命名為, 通過(guò)對(duì)該突變體的遺傳分析和基因定位, 最終發(fā)現(xiàn)是一個(gè)新的基因等位突變體。在突變體中的第6個(gè)內(nèi)含子5￠端供體位點(diǎn)AG/GTAAG (外顯子/內(nèi)含子交接處)的序列+1位G突變?yōu)镃, 從而導(dǎo)致了第6外顯子被錯(cuò)誤地剪切掉, 造成不完整轉(zhuǎn)錄本, 從而導(dǎo)致基因功能的喪失。該突變的發(fā)掘?yàn)檫M(jìn)一步深入解析玉米穗花器官?zèng)Q定提供豐富的實(shí)驗(yàn)材料, 同時(shí)也為RNA加工過(guò)程中剪接位點(diǎn)保守性提供重要證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

玉米雄性不育突變體()為田間發(fā)現(xiàn)的來(lái)源于黃早四(HZ4)背景的自然突變體, 被命名為, 該突變體表現(xiàn)為雄穗不育、雌穗花絲增多;為轉(zhuǎn)座子插入的突變體, 源于Clinton J. Whipplea (Department of Biology, Brigham Young University, Provo, Utah 84602); 自交系B73和HZ4, 以及與自交系B73和HZ4分別雜交構(gòu)建的F2群體。

1.2 突變體的表型鑒定和遺傳分析

由于純合雄性不育突變體不能夠自交繁殖, 只能利用雜合基因型自交后代分離出。因此隨機(jī)選取來(lái)源于雄性不育姊妹株的正?？捎闹仓曜越环敝? 自交后代鑒定有雄性不育株, 然后再取正常植株自交種植, 以此連續(xù)多代自交觀察該突變體表型。對(duì)于突變體表型的遺傳分析, 采用分別與自交系HZ4和B73雜交構(gòu)建F2群體, 散粉期統(tǒng)計(jì)可育單株與不育單株的分離比, 利用卡方測(cè)驗(yàn)確定遺傳模式。

1.3 目的基因的初定位

Bulk Segregant Analysis (BSA)是突變體/主效QTL快速定位的一個(gè)重要方法。利用分離群體野生型和突變體2個(gè)DNA池進(jìn)行全基因組的多態(tài)性分析, 尋找和目標(biāo)基因緊密連鎖的分析標(biāo)記, 進(jìn)行快速初定位[14]。在本實(shí)驗(yàn)中, 利用BSA的方法對(duì)雄性不育突變位點(diǎn)進(jìn)行初定位。首先, 將與B73雜交, 產(chǎn)生F1, 并將F1自交, 構(gòu)建F2分離群體。散粉期, 從田間選取15株不育表型植株, 分別提取DNA等量混合, 構(gòu)建一個(gè)“突變體池”; 同時(shí), 另外選取15株表型正常的植株, 分別提取DNA等量混合, 構(gòu)建了一個(gè)“野生型池”。利用本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)合成的均勻覆蓋玉米基因組的1000對(duì)SSR引物, 對(duì)2個(gè)混池DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增, 毛細(xì)管電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物, 篩選多態(tài)性標(biāo)記, 在突變體DNA混池和野生型DNA混池間存在多態(tài)性的標(biāo)記即為與突變基因緊密連鎖的標(biāo)記。隨后, 利用444株F2分離個(gè)體組成的群體對(duì)獲得的多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行共分離驗(yàn)證并定位突變位點(diǎn)。

1.4 定位區(qū)間基因檢索及等位測(cè)驗(yàn)

根據(jù)基因的初定位區(qū)間, 在MaizeGDB數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站上(http://www.maizegdb.org/)檢索區(qū)間內(nèi)的基因注釋信息, 發(fā)現(xiàn)已經(jīng)報(bào)道的玉米雄穗不育、雌穗花絲增多的基因位于該區(qū)間內(nèi)[15]。為檢測(cè)和是否等位, 利用雜合基因型單株和不育單株雜交, 統(tǒng)計(jì)后代不育單株數(shù)目以及可育單株與不育單株的分離比例。

1.5 基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增和序列分析

在散粉期, 用CTAB法分別提取突變體、、B73和HZ4的基因組DNA[16]。根據(jù)基因組序列, 利用Primer3軟件(http://primer3. ut.ee/)在線設(shè)計(jì)5對(duì)引物-F1/R1~-F5/R5) (表1), 擴(kuò)增產(chǎn)物覆蓋基因組序列。以WT (HZ4和B73)與基因組DNA為模板, 分別擴(kuò)增基因片段, 將PCR產(chǎn)物送武漢天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司測(cè)序。使用CLC軟件比對(duì)分析測(cè)序結(jié)果, 確定基因突變情況。根據(jù)轉(zhuǎn)座子插入位置兩端序列設(shè)計(jì)特異引物F/R, 并結(jié)合轉(zhuǎn)座子序列末端側(cè)翼序列的簡(jiǎn)并引物TIR6 (表1)進(jìn)行基因型分析: 僅_F/R有擴(kuò)增條帶為純合野生型(+/+), 只有F和R分別與TIR6結(jié)合擴(kuò)增出條帶則為純合突變體(), 若3對(duì)標(biāo)記都有擴(kuò)增條帶則為雜合基因型(+/。試驗(yàn)采用南京諾唯贊生物科技有限公司的PCR反應(yīng)試劑, 擴(kuò)增體系為2×PCR Mix 15 μL, 引物(10 μmol L–1) 0.5 μL, 模板DNA 2 μL, 補(bǔ)超純水至30 μL。PCR擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性5 min; 94°C變性30 s, 58°C退火30 s, 72°C延伸1 min, 34個(gè)循環(huán); 68°C延伸5 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶。

1.6 RNA的提取及轉(zhuǎn)錄本的擴(kuò)增

根據(jù)基因型取純合野生型以及突變體雄穗幼穗, 用植物總RNA提取試劑盒提取RNA。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司, Cat# AU311-02)反轉(zhuǎn)錄為cDNA, 以cDNA為模板, 設(shè)計(jì)特異引物-cDNA-F/R (表1), 進(jìn)行CDS擴(kuò)增并測(cè)序(反應(yīng)體系同上)。

表1 Silky1基因相關(guān)的引物

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體msm-6的表型和遺傳分析

主要表現(xiàn)為雄穗不育, 雌穗花絲增多(圖1-A, B)。通過(guò)對(duì)花器官進(jìn)一步的解剖觀察發(fā)現(xiàn),突變體雄花不開(kāi)裂, 花藥退化為膜狀結(jié)構(gòu)并在末端形成了絲狀突出物, 從而造成雄花不育的表型(圖1-C); 雌花花絲增多, 每一個(gè)子房對(duì)應(yīng)2~4個(gè)花絲(圖1-D)。利用雜合基因型自交后代的分離對(duì)進(jìn)行繁殖, 經(jīng)過(guò)連續(xù)自交發(fā)現(xiàn)該突變表型能夠穩(wěn)定遺傳; 將該突變體與HZ4和B73分別雜交, F1表現(xiàn)為野生型, 統(tǒng)計(jì)F1自交得到的2個(gè)F2群體中野生型和突變體的數(shù)目, 經(jīng)卡方檢驗(yàn)其分離比例都符合3∶1 (表2), 表明雄性不育性狀是受單個(gè)隱性核基因控制。

圖1 msm-6突變體雄穗和雌穗表型

A: 野生型(上)和突變體(下)的雄穗表型; B: 野生型(左)和突變體(右)的雌穗表型; C: 野生型(左)和突變體(右)的雄花表型; D: 野生型(左)和突變體(右)的雌花表型。A圖, 標(biāo)尺=5 cm; B圖, 標(biāo)尺=3 cm; C圖, 標(biāo)尺=3 mm; D圖, 標(biāo)尺=3 cm。

A: Tassel of WT (up) and(down); B: Ear of WT (left) and(right); C: Male flower of WT (left) and(right); D: Female flower of WT (left) and(right). Bar = 5 cm in Fig. A; bar = 3 cm in Fig. B; bar = 3 mm in Fig. C; bar = 3 cm in Fig. D.

2.2 msm-6基因定位

利用F2群體, 采用BSA方法在1000對(duì)SSR標(biāo)記中共篩選4對(duì)多態(tài)性標(biāo)記, 分別為C6-24、C6-30、C6-34和C6-40; 根據(jù)B73 V4版本參考基因組信息, 這4對(duì)標(biāo)記都位于玉米第6染色體上, 物理位置分別為68453519、87429100、98078061、107626979 (表3和圖2)。4對(duì)標(biāo)記在野生型DNA池中都擴(kuò)增出雙帶, 而在突變體DNA池中只擴(kuò)增出單帶, 初步推測(cè)這4對(duì)標(biāo)記與突變位點(diǎn)緊密連鎖。進(jìn)而對(duì)444個(gè)F2單株的基因型分析表明, C6-24、C6-30、C6-34和C6-40與突變性狀表型相關(guān)的交換頻率分別為0.045、0、0.011和0.034 (表3), 此結(jié)果不僅驗(yàn)證了BSA結(jié)果的真實(shí)性, 而且確定突變位點(diǎn)與C6-30更緊密連鎖, 最終根據(jù)交換單株的基因型信息將的突變位點(diǎn)定位于標(biāo)記C6-24與C6-34之間約30 Mb的物理區(qū)間內(nèi)(表4)。

圖2 BSA篩選到的與msm-6連鎖標(biāo)記

表2 F2分離群體的卡方測(cè)驗(yàn)

表3 連鎖標(biāo)記信息以及與突變位點(diǎn)的交換頻率

表4 重組單株基因型以及表型信息

H表示雜合基因型; B表示突變體基因型。

H shows the heterozygosity genotype; B shows the genotype of the mutant.

2.3 msm-6和silk1等位測(cè)驗(yàn)

采用基因型為+/雜合單株的花粉和純合突變體雜交, 雜交后代出現(xiàn)了突變表型(圖3), 在調(diào)查的106個(gè)單株中, 表現(xiàn)為野生型表型的為56個(gè), 突變體表型的50個(gè), 卡方檢驗(yàn)分析表明野生型植株與突變體植株的分離比為1︰1 (= 0.56), 證明了可能為新的等位突變體

圖3 msm-6與silky1突變體等位測(cè)驗(yàn)

A: 以雜合+/單株和突變體雜交后代的野生型; B: 以雜合+/單株和突變體雜交后代的突變體。

A: The wild-type plant from×+/; B: The mutant plant from×+/

2.4 msm-6突變位點(diǎn)鑒定

為進(jìn)一步驗(yàn)證和是等位基因并確認(rèn)的突變位點(diǎn), 根據(jù)B73參考基因組序列共設(shè)計(jì)5對(duì)特異引物對(duì)基因啟動(dòng)子以及基因區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 擴(kuò)增模板為WT(HZ4)和基因組DNA, 擴(kuò)增產(chǎn)物從1237 bp到1562 bp跨疊式覆蓋了基因組序列(表1)。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序分析發(fā)現(xiàn),突變體中第6個(gè)內(nèi)含子5'端供體位點(diǎn)AG/GTAAG (外顯子/內(nèi)含子交接處)的序列+1位G突變?yōu)镃 (圖4-A, B)。而已報(bào)導(dǎo)的突變體、和均由轉(zhuǎn)座子的插入造成, 以上研究結(jié)果充分證實(shí)是一個(gè)新的等位突變體。

2.5 Silky1基因在msm-6突變體中的轉(zhuǎn)錄本擴(kuò)增

分別取純合突變體和純合野生型雄穗幼穗提取RNA, 反轉(zhuǎn)錄為cDNA, 對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行擴(kuò)增, 結(jié)果顯示, 與野生型相比, 突變體轉(zhuǎn)錄本變小(圖5-A)。通過(guò)進(jìn)一步的測(cè)序分析發(fā)現(xiàn),突變體中轉(zhuǎn)錄本第6個(gè)外顯子缺失(圖5-B)。轉(zhuǎn)錄本的不完整性造成了該基因的功能缺失, 產(chǎn)生相關(guān)的突變表型。

圖4 msm-6突變位點(diǎn)鑒定

A: 野生型以及突變體的序列分析; 箭頭指示突變位點(diǎn)。B:基因結(jié)構(gòu)示意圖及2個(gè)突變體的突變位置。

A: The sequence analysis of WT and; The arrow indicates the mutation site. B: Gene structure ofand mutation site of two mutants.

圖5 msm-6突變體中Silky1轉(zhuǎn)錄本Exon6的缺失

A:轉(zhuǎn)錄本在野生型和突變體中的擴(kuò)增; B:轉(zhuǎn)錄本在野生型和突變體中的序列分析。

A: PCR product oftranscript between WT and6;B: The sequence analysis oftranscript between WT and

3 討論

BSA是突變體/主效QTL快速定位的一個(gè)重要方法[16]。利用分離群體野生型和突變體2個(gè)DNA池進(jìn)行全基因組的多態(tài)性分析, 就能夠快速找到與基因/QTL連鎖的分子標(biāo)記, 確定基因/QTL所在區(qū)間位置, 該方法簡(jiǎn)單快速, 并且節(jié)約成本, 得到了廣泛應(yīng)用[17-18]。在玉米上, 通過(guò)BSA的方法定位及克隆了許多基因/位點(diǎn)。Cai等[19]采用1000個(gè)覆蓋玉米全基因組的SSR標(biāo)記對(duì)突變體以及野生型DNA混池進(jìn)行基因型分析, 成功定位克隆了一個(gè)控制玉米籽粒發(fā)育的基因。Zhao等[20]鑒定到了一個(gè)雌穗無(wú)花絲的突變體, 通過(guò)構(gòu)建DNA混池, 并結(jié)合228個(gè)覆蓋玉米全基因組的SSR標(biāo)記將定位于第2染色體, 并通過(guò)進(jìn)一步精細(xì)定位將其成功克隆。Strable等[21]利用BSA的方法將控制葉片下垂的突變基因以及分別定位于第1染色體短臂以及9號(hào)染色體長(zhǎng)臂, 同樣通過(guò)精細(xì)定位成功將其克隆。本研究采用F2分離群體的野生型和突變體各15株, 及BSA策略快速將定位于第6染色體68.5~98.1 Mb的區(qū)間內(nèi), 實(shí)驗(yàn)結(jié)果真實(shí)可靠。

等位測(cè)驗(yàn)是通過(guò)雜交試驗(yàn)對(duì)雜交后代性狀的分離進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 確定基因之間的等位性。本研究中, 由于雄性不育突變體不能產(chǎn)生后代, 因此, 只能利用+/雜合單株的花粉和純合突變體雜交進(jìn)行初步的等位性檢測(cè), 初步驗(yàn)證了和的等位性進(jìn)而利用基因序列分析鑒定真實(shí)的突變位點(diǎn), 結(jié)合基因在突變體中的轉(zhuǎn)錄本擴(kuò)增結(jié)果, 充分證明是的一個(gè)新等位基因

剪接位點(diǎn)的識(shí)別是RNA內(nèi)含子剪接加工過(guò)程中非常關(guān)鍵一步, 而且剪接位點(diǎn)的序列在各物種間都是相對(duì)比較保守的, 因此剪接位點(diǎn)的變異很可能會(huì)造成mRNA的錯(cuò)誤加工, 導(dǎo)致基因功能的喪失。基因的第32個(gè)內(nèi)含子第5位堿基由G突變?yōu)锳 (4518+5G > A), 造成了剪接位點(diǎn)的失活, 從而形成了錯(cuò)誤的剪接以及轉(zhuǎn)錄的提前終止, 導(dǎo)致杜氏肌萎縮癥發(fā)生[22]。膽固醇轉(zhuǎn)移蛋白基因()第1個(gè)內(nèi)含子剪接供體位點(diǎn)的突變, 造成蛋白的移碼突變, 從而導(dǎo)致高α脂蛋白血癥發(fā)生[23]。在水稻中,基因的第1個(gè)內(nèi)含子的剪接位點(diǎn)前2個(gè)堿基由GT突變?yōu)門(mén)T, 從而影響了轉(zhuǎn)錄本的正常剪接, 導(dǎo)致蛋白功能的缺失[24]。玉米中,的等位突變體-是第3個(gè)內(nèi)含子的5￠端剪接位點(diǎn)由GT突變?yōu)锳T造成的, 該堿基的突變?cè)斐闪嗽摷艚游稽c(diǎn)的失活以及另外2個(gè)臨近剪切位點(diǎn)的激活, 從而產(chǎn)生了包含第3個(gè)內(nèi)含子的轉(zhuǎn)錄本以及缺失第3個(gè)外顯子的轉(zhuǎn)錄本, 而這2種轉(zhuǎn)錄本都不能翻譯成有功能的蛋白, 造成胚乳發(fā)育缺陷表型[25]。本研究發(fā)現(xiàn), 在中,基因第6個(gè)內(nèi)含子的剪接供體位點(diǎn)第1個(gè)堿基由G突變?yōu)镃, 造成了剪接位點(diǎn)不能被正常識(shí)別, 導(dǎo)致第6個(gè)外顯子連同第6個(gè)內(nèi)含子一起被剪切掉, 形成了1個(gè)第6個(gè)外顯子缺失的不完整轉(zhuǎn)錄本, 導(dǎo)致表型產(chǎn)生。

Ambrose等[6]采用分離轉(zhuǎn)座子側(cè)翼序列標(biāo)簽法從和共3個(gè)突變體中成功分離克隆了基因。在這3個(gè)突變體中, 轉(zhuǎn)座子分別插入在第3個(gè)內(nèi)含子、第1個(gè)內(nèi)含子以及第2個(gè)外顯子, 并影響了該基因的轉(zhuǎn)錄, 造成雄花不育, 漿片以及花藥退化為膜狀結(jié)構(gòu), 并在末端形成了絲狀突出物、雌花可育、花絲增多的突變表型。根據(jù)蛋白同源分析發(fā)現(xiàn)該基因編碼1個(gè)B功能DEF/ AP3蛋白, 其同源基因在擬南芥和金魚(yú)草中早有報(bào)道, 同樣參與花器官的決定, 會(huì)造成突變體花瓣轉(zhuǎn)化為萼片以及雄蕊[26]。本研究獲得了1個(gè)新的等位突變體, 該突變體和已報(bào)道的突變體具有相似的表型。該突變體的突變位點(diǎn)位于第6個(gè)內(nèi)含子第1個(gè)堿基, 由G突變?yōu)镃, 導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄本不能夠正常剪切, 第6個(gè)外顯子缺失, 影響轉(zhuǎn)錄后加工過(guò)程, 與前人報(bào)道的基因影響轉(zhuǎn)錄過(guò)程不同。

4 結(jié)論

發(fā)現(xiàn)了一個(gè)玉米雄性不育突變體材料,是基因的一個(gè)新等位突變體。在突變體中,的第6個(gè)內(nèi)含子5￠端供體位點(diǎn)AG/GTAAG (外顯子/內(nèi)含子交接處)的序列+1位G突變?yōu)镃, 導(dǎo)致第6外顯子被錯(cuò)誤地剪切掉, 產(chǎn)生不完整轉(zhuǎn)錄本, 喪失基因功能。的發(fā)現(xiàn)與鑒定為進(jìn)一步深入解析玉米穗花器官?zèng)Q定的遺傳機(jī)理提供豐富的試驗(yàn)材料, 同時(shí)也為RNA加工過(guò)程中剪接位點(diǎn)保守性提供重要證據(jù)。

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Genetic analysis and molecular characterization of a new allelic mutant ofgene in maize

WANG Xiao-Juan1,**, PAN Zhen-Yuan2,**, LIU Min2, LIU Zhong-Xiang1, ZHOU Yu-Qian1, HE Hai-Jun1, and QIU Fa-Zhan2,*

1Crops Research Institute, Gansu Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730070, Gansu, China;2National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Huazhong Agricultural University, Wuhan, 430070, Hubei, China

We identified a new maize male sterile mutant in early experiment, designated as. This mutant characters were steadily inherited and genetically regulated by a single recessive gene. An F2population was developed by crossing B73 inbred line to, and four SSR markers (C6-24, C6-30, C6-34, and C6-40) closely linked to this locus were identified by BSA (Bulked Segregant Analysis) method. The 444 F2individuals were used to map the target gene in an interval from 68.5 to 98.1 Mb between markers C6-24 and C6-34 on chromosome 6. Using genomic sequence database, we found thatgenewas located in this mapping region.encodes a B function MADS box protein of ABCD model for floral organ establishment. The mutation ofled to sterile stamen and more silks of the ear. By crossing heterozygous +/plants to homozygousplants, we found a 1:1 segregation ratio for normal to male sterile plants.Genomic and cDNA sequences ofdisclosed a single-nucleotide change from G to C at the first position of intron 6, which resulted in exon 6 skipping, producing aberrant mRNAs without exon 6. Sois a new allele mutant of, which is different from,, andcaused by the insertion of mutator transposons. The identification ofprovides not only abundant experimental materials for the study of the floral organ determination in maize, but also important evidence for the conservation of splicing sites in RNA processing.

maize;genetic analysis;;gene mapping; allelic mutant

本研究由國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“七大農(nóng)作物育種”專(zhuān)項(xiàng)(2018YFD0100202-3)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2018YFD0100202-3).

2019-02-26;

2019-05-12;

2019-06-03.

邱法展, E-mail: qiufazhan@mail.hzau.edu.cn

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

王曉娟, E-mail: wangxj839@sina.com; 潘振遠(yuǎn), E-mail: panzhenyuandawood@163.com

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190603.0848.004.html

10.3724/SP.J.1006.2019.93009