彭 巧，馬洪鑫，程 浩，張福梅，王亞杰，高丹丹

（1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730124；2.西北民族大學(xué)實驗教學(xué)部，甘肅蘭州 730030）

人體細胞利用氧氣產(chǎn)生能量，而自由基是新陳代謝的結(jié)果。人體有相對穩(wěn)定的抗氧化防御體系，但隨著年齡的增長或機體處于不良的外界環(huán)境時，體內(nèi)的自由基產(chǎn)生過多或清除過慢會造成細胞生物膜被破壞、肽鏈特殊基團或肽鍵產(chǎn)生干擾及脫氧核糖核酸分子結(jié)構(gòu)改變，進而引起多不飽和脂肪酸氧化，導(dǎo)致慢性和退行性疾病[1]。此外，食品氧化會使食品腐敗變質(zhì)，甚至?xí)a(chǎn)生致突變的物質(zhì)?？寡趸瘎┦且环N能夠延緩或抑制食物或人體氧化過程，預(yù)防氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的物質(zhì)，具有阻止自由基的形成或清除自由基、過氧化氫和其他過氧化物，從而發(fā)揮抗氧化作用[2]。目前常見的化學(xué)合成抗氧化劑主要是酚類化合物，如2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）、叔丁基對羥基茴香醚（BHA）、叔丁基氫醌（TBHQ）、沒食子酸丙酯（PG）等。這些抗氧化劑能通過釋放氫離子形成自由基，終止自由基傳遞鏈反應(yīng)，從而阻斷油脂自動氧化，應(yīng)用于食品中可以防止植物油的氧化酸敗、延長油脂的貯藏期，應(yīng)用于化妝品中，可抑制皮脂的產(chǎn)生，降低皮膚表面色素的沉著度，有延緩衰老、抗皺去紋的功效。但是，這些化學(xué)抗氧化劑存在一定的毒理作用，Goodman D L等人[3]發(fā)現(xiàn)BHT與BHA似乎能夠加重某些慢性蕁麻疹患者的癥狀。有研究表明，服用大劑量TBHQ可引起惡心、虛脫、耳鳴、嘔吐和急性腦綜合征；可使兒童患多動癥、哮喘及皮炎、鼻炎炎癥，還可影響女性雌激素水平。我國對這些抗氧化劑的使用范圍和劑量也做出了嚴格的規(guī)定。因此、安全性高、副作用小的天然抗氧化劑更加受到人們的青睞，如黃酮、單寧、維生素類、茶多酚等。

近年來，乳源蛋白抗氧化肽的研究備受國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，許多學(xué)者從各類乳蛋白中發(fā)現(xiàn)了具有抗氧化活性的肽段。1979年，Brantl V等人[4]首次從牛乳酪蛋白中發(fā)現(xiàn)了具有類嗎啡活性的肽類物質(zhì)，乳源生物活性肽的研究迅速發(fā)展。乳蛋白經(jīng)消化后可以產(chǎn)生具有抗氧化活性的物質(zhì)，這些物質(zhì)是由1～20個氨基酸以不同組成和排列形式構(gòu)成的肽類物質(zhì)，其分子質(zhì)量通常在5 ku以下。乳蛋白抗氧化肽能通過多種途徑抑制脂質(zhì)氧化，包括活性氧的失活、自由基的清除、螯合金屬離子、減少氫過氧化物和改變食品體系的物理性質(zhì)等，調(diào)整及改善機體生理功能，從而促進人體健康。主要介紹乳蛋白的分類、制備和分離純化乳源抗氧化肽的方法，分析抗氧化肽的研究現(xiàn)狀，為今后乳蛋白抗氧化肽及其相關(guān)產(chǎn)品的進一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 乳蛋白分類

乳蛋白營養(yǎng)價值高，包含人體所需全部氨基酸，結(jié)構(gòu)比例合理，能促進人體的生長發(fā)育和各項生理代謝活動；其生物價達到85，易被人體吸收，是有益于人體健康的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)。乳蛋白按照在乳中呈現(xiàn)狀態(tài)可分為乳清蛋白、酪蛋白、部分的乳脂肪球膜蛋白和其他蛋白。

1.1 酪蛋白

酪蛋白又稱乳酪、干酪素，是動物乳中特有的一種含磷鈣的結(jié)合蛋白質(zhì)。在牛乳、人乳、驢乳和羊乳中，其含量分別為總蛋白質(zhì)的80%，29%，35%，75%[5]。酪蛋白分為αs-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白三大類，其分子量大都在20～25 ku。其中含量最多的是αs-酪蛋白，在脫脂牛乳中αs-酪蛋白占總酪蛋白含量的38%。在總αs-酪蛋白中，80%為αs1-酪蛋白，分子量為23.5 ku；20%為αs2-酪蛋白，分子量為25.2 ku。β-酪蛋白含量比αs-酪蛋白略低，在牛乳脫脂乳中總酪蛋白含量為35%，分子量為24 ku。κ-酪蛋白含量在脫脂牛乳酪蛋白中約為13%，分子質(zhì)量為19 ku；κ-酪蛋白對鈣不敏感而對凝乳酶敏感，是乳中唯一含有糖成分的酪蛋白[6]。

1.2 乳清蛋白

乳清蛋白是脫脂乳去除酪蛋白沉淀之后上清液中多種蛋白質(zhì)組分的統(tǒng)稱，在牛乳總蛋白質(zhì)含量的20%，在人乳中約為總蛋白質(zhì)的71%，在驢乳中約為總蛋白質(zhì)的64%，在羊乳中為總蛋白質(zhì)的23%～25%[12]。乳清蛋白可分為α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白、乳鐵蛋白、乳過氧化物酶、生物活性因子等。含量最多的是β-乳球蛋白，分子量為17 ku，為乳清蛋白總量的50%～55%；其次是α-乳白蛋白，分子量為12 ku，其含量與乳清蛋白總量的20%～25%；免疫球蛋白分為重鏈蛋白與輕鏈蛋白，重鏈的含量為10%～15%，牛血清白蛋白分子量為67 ku，其含量為乳清蛋白總含量的5%～10%，其他種類蛋白如乳鐵蛋白等共占乳清蛋白總含量的11.5%～17.0%[7-8]。

1.3 乳脂肪球膜蛋白

乳脂肪球膜蛋白以一種微小的球狀物存在于乳中，球狀直徑為0.2～15.0μm，被一層乳脂肪球膜包裹著。乳脂肪膜球蛋白是一種膜結(jié)合蛋白，含有25%～60%的蛋白質(zhì)，占乳中蛋白質(zhì)的1%～2%[9]。

1.4 其他蛋白

除以上幾種特殊蛋白質(zhì)外，乳蛋白還含少量的其他蛋白質(zhì)和酶蛋白，如酒精可溶性蛋白及血纖蛋白相類似的蛋白。

2 乳源抗氧化肽的制備

乳蛋白抗氧化肽常用的制備方法有酶法與微生物發(fā)酵法2種。酶法制備中常用的蛋白酶主要有胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和木瓜蛋白酶等，酶法反應(yīng)條件溫和、無異味、安全、催化位置有方向性，但反應(yīng)副產(chǎn)物多、產(chǎn)率低。微生物發(fā)酵法是利用瑞士乳桿菌、保加利亞乳桿菌及鼠李糖乳桿菌GG株等微生物，在有氧或無氧條件下的生命活動來生產(chǎn)不同氨基酸序列和分子量的肽，這些肽類是微生物菌體本身，或者直接代謝產(chǎn)物或次級代謝產(chǎn)物，微生物種類多、繁殖快、培養(yǎng)簡單，利用其法制備成本低、產(chǎn)率高，但存在菌種不穩(wěn)定、易產(chǎn)生變異、產(chǎn)物不穩(wěn)定等缺點。近年來，國內(nèi)外學(xué)者采用微生物法和酶法水解不同乳蛋白制備了大量乳源抗氧化肽，并對其序列進行分離純化。

乳源性抗氧化肽的制備方法及其序列見表1。

3 乳蛋白抗氧化肽的分離純化及鑒定

乳蛋白抗氧化肽的氨基酸序列，直接影響其抗氧化活性。對其進行分離純化和鑒定，對進一步研究其構(gòu)效關(guān)系有很大的意義。目前常用的方法主要有超濾、離子交換、凝膠層析、親和層析、高效液相色譜（HPLC）、毛細管電泳和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）等。

3.1 超濾

超濾是一種依據(jù)膜截留分子量來分離物質(zhì)的技術(shù)，即在一定壓力（一般為0.1～0.5 MPa）下，樣品被壓入系統(tǒng)，不同分子量的物質(zhì)經(jīng)過膜時，超過膜體積的大分子物質(zhì)被膜體積截留并作為濃縮物再循環(huán)，溶劑和小分子物質(zhì)將通過膜并作為滲透劑被收集，從而達到分離純化的目的。在分離純化乳蛋白抗氧化肽時，通常把超濾作為初步分離的手段。Chang O K等人[28]將牛酪蛋白水解產(chǎn)物超濾24 h，分離出＞10 ku，3～10 ku，＜3 ku 3個組分，發(fā)現(xiàn)＜3 ku組分顯示出最高的抗氧化活性。Puchalska P等人[33]采用3，5，10 ku的分子量截流過濾器對一定濃度的嬰兒配方奶粉進行超濾，得到分子量為5～10 ku，3～5 ku和小于3 ku的3個級分，然后進一步分離純化，鑒定出內(nèi)源抗氧化肽和ACE抑制肽的序列結(jié)構(gòu)。Kumar D等人[34]采用超濾技術(shù)對駱駝乳蛋白水解產(chǎn)物進行分餾，在組分F2（1～5 ku）和F3（5～10 ku）均表現(xiàn)出較高的抗氧化活性，表明駱駝乳蛋白是生產(chǎn)蛋白質(zhì)水解物的有價值的來源。

表1 乳源性抗氧化肽的制備方法及其序列

3.2 凝膠層析

凝膠層析可用于分離不同大小的分子。凝膠過濾柱的柱材由交聯(lián)聚丙烯酰胺、瓊脂糖、葡聚糖等凝膠顆粒構(gòu)成，目前常用的葡聚糖凝膠有Sephadex和Sephacryl兩大類。樣品進入凝膠過濾柱后，由于分子量大的物料直徑比凝膠顆?？讖酱螅谀z顆粒間的空隙流動速率快而最先被洗脫，反之，分子量小的物料由于直徑比凝膠顆粒孔徑小可自由進出凝膠顆粒，在層析過程中，由一個凝膠顆粒進入另一個凝膠顆粒，流動速率慢而最后被洗脫。目前，凝膠層析技術(shù)，并已成功地應(yīng)用于凝膠層析技術(shù)，并已成功地應(yīng)用于純化各種來源的蛋白質(zhì)和多肽。郁曉盼[35]通過對比SephadexG-25和SephadexG-15凝膠層析處理超濾過的牛乳酪蛋白酶解液的存在的差異，發(fā)現(xiàn)2種處理液都有4個主要洗脫峰，同時SephadexG-15的分離度要高于SephadexG-25，這與2種凝膠的分離范圍有關(guān)。Peng X等人[36]應(yīng)用SephadexG-10凝膠過濾層析處理堿性酶水解后的乳清蛋白得到4個組分：＞40 ku，2.8～40 ku，0.1～2.8 ku和＜0.1 ku肽段。Tugba Bayram等人[37]現(xiàn)采用SephadexG-200柱層析處理乳清液得到3個組分，然后再將含有對乳球蛋白和α-乳球蛋白的組分經(jīng)SephadexG-200柱層析，得到3個組分：第1組為牛血清白蛋白，第2組為β-乳球蛋白，第3組為小肽。

3.3 高效液相色譜（HPLC）

高效液相色譜法是借助高壓將樣品注入系統(tǒng)，各成分發(fā)生分離后，然后進入檢測器檢測，從而實現(xiàn)對樣品的分離鑒定的分析方法。目前，應(yīng)用于多肽分離純化的高效液相色譜法主要分為多維高效液相色譜、反相高效液相色譜法、離子交換色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法等。Tsopmo A等人[38]采用高效液相色譜法（HPLC）分離人乳水解物得到23個組分，其中色氨酸（Trp）、多肽HNPI和PLAPQA是主要成分。Hernandezledesma B等人[39]采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）對發(fā)酵乳大部分活性組分的多肽進行了串聯(lián)質(zhì)譜測定，識別出了各種潛在的活性多肽。Jrad Z等人[40]在研究駱駝奶和駱駝初乳蛋白的生物活性片段中，采用反相高效液相色譜對蛋白質(zhì)的水解物進行了表征，根據(jù)峰值發(fā)現(xiàn)大多數(shù)蛋白質(zhì)被水解成小肽。

3.4 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDITOF-MS）

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜工作原理是樣品與小分子基質(zhì)均勻混合，在離子源室內(nèi)，基質(zhì)與樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移，使樣品分子離子化；然后在電場作用下進入飛行時間質(zhì)量分析器中加速，由到達檢測器的飛行時間算出其質(zhì)荷比，對樣品進行定量定性分析[41]。其法操作簡單且快速、精確度高、檢測質(zhì)量范圍廣，適合于各種多肽精確質(zhì)量數(shù)測定。劉志東等人[12]采用MALDI-TOF-MS法鑒定出牛乳乳清蛋白中具有抗氧化活性的肽段序列為HIR。Homayounitabrizi M等人[19]利用MALDI-TOF-MS法測定出駱駝乳蛋白水解物中的3種多肽序列。Ibrahim H R等人[20]通過MALDI-TOF-MS法分析駱駝奶蛋白水解液中的活性肽，鑒定了多種質(zhì)量范圍在913～2 951 Da的抗氧化肽。

4 結(jié)語

乳源抗氧化肽在促進人體健康和預(yù)防疾病方面有較高的生物價值，可作為抗氧化劑應(yīng)用到功能性食品或保健品中，可有效預(yù)防人體各種慢性疾病，也可以緩解相關(guān)疾病的癥狀，如肥胖、腫瘤、血管硬化、心腦血管疾病、炎癥疾病等；此外，抗氧化肽還具有清除皮膚中的自由基，減少或預(yù)防皮膚老化的潛能。目前，許多研究者已經(jīng)從乳源蛋白水解物中獲得了很多抗氧化肽，并鑒定出了其結(jié)構(gòu)序列，但是應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)和臨床干預(yù)的抗氧化肽并不多。主要是與化學(xué)合成抗氧化劑相比，大多數(shù)乳源性抗氧化肽的活性和體內(nèi)穩(wěn)定性相對較低，其作用機制和構(gòu)效關(guān)系的研究較少，目前已建立的構(gòu)效關(guān)系模型缺乏代表性，無法解釋所有類型抗氧化肽的作用機制，限制其進一步開發(fā)利用。因此，乳源蛋白抗氧化肽的定向修飾技術(shù)進一步改進和構(gòu)效關(guān)系的進一步深入研究，將打破這些瓶頸問題，為乳源蛋白抗氧化肽的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。