陸曉云，張斌，佟芳

（ 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1. 婦產(chǎn)科； 2. 腫瘤科，遼寧 大連 116011）

卵巢癌是女性常見(jiàn)的具有較高惡性程度的腫瘤，5年生存率僅為25%～35%［1］。卵巢癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，復(fù)發(fā)率高，雖然目前卵巢癌治療取得了明顯的進(jìn)展，但其長(zhǎng)期預(yù)后差。因此了解卵巢癌的發(fā)病機(jī)制可以為臨床治療提供理論基礎(chǔ)。高遷移率族蛋白A2 （high mobility group protein A2，HMGA2） 是一類(lèi)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子，在很多腫瘤中過(guò)表達(dá)，在卵巢癌組織中也過(guò)表達(dá)，可能與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)［2］。HMGA2可以通過(guò)蛋白質(zhì)-DNA或者蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用調(diào)節(jié)多個(gè)基因來(lái)發(fā)揮作用。HMGA2作為腫瘤蛋白在很多癌癥 （乳腺癌、食管鱗狀癌、結(jié)直腸癌和卵巢癌等） 中表達(dá)上調(diào)［3-6］，但HMGA2在卵巢癌中的調(diào)控機(jī)制仍不清楚。

微小RNA （microRNA，miRNA） 是一類(lèi)長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸小分子的非編碼 RNA，它通過(guò)與靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)結(jié)合而抑制靶基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而終止基因翻譯［7］。有研究［8］報(bào)道m(xù)iRNA 在很多種類(lèi)腫瘤中表達(dá)異常，發(fā)揮著致癌或抑制癌癥的作用。研究［9］發(fā)現(xiàn) miR-142-3p在結(jié)直腸癌中表達(dá)降低。本研究擬分析miR-142-3p在卵巢癌組織中的表達(dá)，并探討 miR-142-3p對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響。

1 材料與方法

1.1 卵巢癌標(biāo)本與試劑

收集2017年8月至2018年7月大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科40例卵巢癌女性患者的卵巢癌組織標(biāo)本，患者年齡30～75歲，平均年齡61.5歲。其中20例患者取癌旁正常組織 （癌邊緣2.5～3.5 cm） 放入準(zhǔn)備好的凍存管，保存于液氮里。臨床病例資料完整，病理診斷和分期，組織分化程度等均有相關(guān)證據(jù)。試劑包括人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3 （中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心）、DMEM培養(yǎng)基 （美國(guó)Hyclone公司）、 Trizol與轉(zhuǎn)染所用脂質(zhì)體 （美國(guó)invitrogen公司）、miR-142-3p引物與U6 引物 （大連寶生物工程有限公司合成）、miR-142-3p和HMGA2模擬物及對(duì)照序列 （大連寶生物工程有限公司合成）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

SKOV3細(xì)胞使用DMEM培養(yǎng)基 （含10%新生胎牛血清），在5%CO2、 37 ℃、95%濕度下培養(yǎng)。將miRNA-空白對(duì)照 （miR-NC） 或miR-142-3p、HMGA2模擬物轉(zhuǎn)染至人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后留作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞Transwell 測(cè)定

用miR-142-3p模擬物或HMGA2過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞或用miR-142-3p抑制劑預(yù)處理細(xì)胞。48 h后細(xì)胞在血清剝奪培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，用胰蛋白酶消化，然后接種在24孔透孔培養(yǎng)基 （Promega） 的頂部培養(yǎng)室中。在培養(yǎng)基中加入20%血清作為下腔的化學(xué)吸引劑。24 h后用4%甲醛固定細(xì)胞10 min，然后用0.005%結(jié)晶紫染色，相差顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定

取約0.2 g組織，放入有少許液氮的研缽中，加入Trizol研碎，提取總RNA，mRNA逆轉(zhuǎn)錄，以U6為內(nèi)參，進(jìn)行PCR 反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中所用的引物序列如下：HMGA2上游引物：5’-CTCAAAAGAAAGCAGAAGC CACTG-3’，反向引物：5’-TGAGCAGGCTCTTCTGAA CAACT-3’；miR-142-3p莖環(huán)引物 5’-CTCAACTGGTG TCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCCATAAA-3’，上游引物：5’ -CTCCAGCTGGGTGTAGTGTTTCCTAC TT -3’，反向引物：5’ -GTCGTGGAGTCGGCAAT-3’；U6 莖環(huán)引物 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG GTATTCGCACTGGATACGACAAAATATGGAAC- 3’，上 游 引 物：5’-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAG C-3’，反向引物：5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’。

1.5 Western blotting

在細(xì)胞培養(yǎng)皿加入蛋白裂解液，用槍頭反復(fù)抽打，裂解20 min后，將蛋白裂解液移至1.5 mL EP管中，4 ℃高速離心15 min后取上清液，采用BCA法檢測(cè)樣品蛋白濃度，用裂解液配平。加入5×上樣緩沖液煮沸，進(jìn)行蛋白變性8 min。上樣進(jìn)行電泳，濃縮膠80 V 40 min，分離膠120 V 80 min，轉(zhuǎn)膜 100 V 60 min，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5% 脫脂奶粉封閉1 h后，一抗anti-HMGA2 （1∶500，美國(guó)Santa Cruz公司）、GAPDH （1∶2 000，美國(guó)Santa Cruz公司） 4 ℃孵育過(guò)夜；室溫TBST洗3次，5 min/次，加入HRP兔抗二抗 （1∶1 000），室溫孵育1 h；TBST洗3次，5 min/次；ECL發(fā)光液發(fā)光。計(jì)算成像后蛋白條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-142-3p在卵巢癌組織的表達(dá)情況

結(jié)果顯示，miR-142-3p在卵巢癌組織表達(dá)為0.42±0.12，癌旁正常組織表達(dá)為0.98±0.15，二者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P ＜ 0.01）。 HMGA2在卵巢癌組織的表達(dá)為 0.97±0.13，癌旁正常組織的表達(dá)為0.52±0.16，二者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P ＜ 0.01）。Pearson相關(guān)分析表明卵巢癌組織中miR-142-3p表達(dá)與HMGA2 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān) （r = -0.707 4，P ＜ 0.05）。利用Target Scan 和mi Target等軟件進(jìn)行生物學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-142-3p與HMGA2的3’-UTR結(jié)合，見(jiàn)圖1。

2.2 miR-142-3p過(guò)表達(dá)抑制SKOV3細(xì)胞的遷移和侵襲

圖1 miR-142-3p靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.1 Prediction of target genes of miR-142-3p

采用miR-142-3p過(guò)表達(dá)載體 （miR-142-3p模擬物） 轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞，或用miR-142-3p的抑制劑預(yù)處理48 h。結(jié)果顯示，與miR-142-3p模擬物交叉感染后，miR-142-3p表達(dá)顯著增加；而抑制劑預(yù)處理明顯抑制了miR-142-3p表達(dá) （表1）。在Transwell實(shí)驗(yàn)中，miR-142-3p過(guò)表達(dá)導(dǎo)致SKOV3細(xì)胞遷移和侵襲顯著抑制；與干擾組比較，miR-142-3p抑制劑處理增強(qiáng)了SKOV3細(xì)胞遷移和侵入。見(jiàn)表1、圖2。本研究結(jié)果表明，體外miR-142-3p表達(dá)增強(qiáng)對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲具有抑制作用。

表1 3組細(xì)胞中miR-142-3p mRNA表達(dá)以及SKOV3細(xì)胞遷移、侵襲情況比較Tab.1 Expression of miR-142-3p mRNA and SKOV3 ovarian cancer cell migration and invasion among three groups

圖2 miR-142-3p抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞的遷移和侵襲 ×400Fig.2 miR-142-3p inhibits migration and invasion of ovarian cancer SKOV3 cells ×400

2.3 HMGA2逆轉(zhuǎn)miR-142-3p引起的細(xì)胞遷移和侵襲

為了確定HMGA2是否參與了miR-142-3p對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用，本研究構(gòu)建了HMGA2過(guò)表達(dá)載體，并成功導(dǎo)入SKOV3 細(xì)胞中。Western blotting檢測(cè)結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后，SKOV3細(xì)胞中HMGA2表達(dá)顯著增加。上調(diào)HMGA2顯著逆轉(zhuǎn)了miR-142-3p誘導(dǎo)的遷移和侵襲抑制，見(jiàn)表2、圖3。證實(shí)HMGA2參與了miR-142-3p介導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)。

2.4 過(guò)表達(dá)miR-142-3p降低HMGA2的表達(dá)

表2 HMGA2表達(dá)上調(diào)后SKOV3細(xì)胞遷移和侵襲結(jié)果比較Tab.2 Comparison of migration and invasion of SKOV3 cells after up-regulation of HMGA2 expression

結(jié)果顯示，對(duì)照組、NC組、模擬組SKOV3細(xì)胞中HMGA2 mRNA表達(dá)分別為1.0±0.11， 1.0±0.09，0.4±0.03。與對(duì)照組比較， 模擬組SKOV3細(xì)胞中HMGA2 mRNA表達(dá)明顯下調(diào) （P ＜ 0.05） ；HMGA2蛋白表達(dá)也明顯下調(diào)，見(jiàn)圖4。

圖3 HMGA2過(guò)表達(dá)抑制miR-142-3p誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移和侵襲×400 Fig.3 Overexpression of HMGA2 inhibits miR-142-3p induced cell migration and invasion ×400

圖4 SKOV3細(xì)胞中HMGA2蛋白表達(dá)Fig.4 HMGA2 protein expression in SKOV3 cells

3 討論

研究［10］顯示，卵巢癌生存率較低，可能與卵巢癌惡性程度及復(fù)雜的生物學(xué)特征有關(guān)。很多腫瘤形成的相關(guān)因子與卵巢癌的發(fā)展有關(guān)，但其發(fā)病機(jī)制仍未闡明［11］。miR-142發(fā)現(xiàn)于造血細(xì)胞［12］，DUDEK等［13］研究結(jié)果表明，mir-142-3p是一種新的β-連環(huán)蛋白抑制劑，有可能是未來(lái)腫瘤治療的候選靶點(diǎn)。有研究［14］報(bào)道在子宮頸癌細(xì)胞中miR-142-3p 能夠通過(guò)作用FZD7 抑制細(xì)胞的增殖和侵襲。

miR-142-3p作為抑癌因子在多種腫瘤組織或細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，本研究比較了卵巢癌患者標(biāo)本與癌旁組織中miR-142-3p表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-142-3p在卵巢癌組織中表達(dá)明顯低于癌旁組織，提示miR-142-3p可能是抑癌因子，能夠發(fā)揮抑癌作用。結(jié)果又發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-142-3p能夠顯著抑制SKOV3 細(xì)胞的遷移和侵入能力，表明miR-142-3p具有抑制卵巢癌細(xì)胞侵襲和遷移的作用。

每一個(gè)miRNA通常會(huì)作用多個(gè)靶基因，通過(guò)對(duì)其調(diào)控而發(fā)揮不同的生物學(xué)功能。本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)miR-142-3p結(jié)合HMGA2 mRNA的3’UTR。HMGA2高度表達(dá)于胚胎發(fā)育過(guò)程中，在很多成熟和分化的組織中幾乎不表達(dá)。有研究［15］發(fā)現(xiàn)，多種人惡性腫瘤中高表達(dá)HMGA2，HMGA2參與腫瘤細(xì)胞的不同活動(dòng)。HMGA2過(guò)表達(dá)與乳腺癌和胰腺癌腫瘤等發(fā)生、發(fā)展有關(guān)［16-17］。已有文獻(xiàn)報(bào)道HMGA2參與腫瘤 （卵巢癌［18-19］等） 發(fā)生的不同步驟，本研究結(jié)果顯示，HMGA2與miR-142-3p在卵巢癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與以往研究結(jié)果一致。

本研究將miR-142-3p模擬物轉(zhuǎn)染SKOV3 細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)SKOV3 細(xì)胞的侵襲和遷移能力均下降；Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HMGA2能夠降低miR-142-3p對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲和遷移的抑制作用。說(shuō)明miR-142-3p可能通過(guò)下調(diào)HMGA2基因來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移，而HMGA2能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移。

綜上所述，miR-142-3p表達(dá)增加能夠抑制SKOV3細(xì)胞中HMGA2 mRNA和蛋白表達(dá)，并抑制SKOV3細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。本研究對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移和侵入的機(jī)制進(jìn)行了探討，為臨床治療卵巢癌提供了理論依據(jù)。