郭耀東，王 飛，董少杰，王圣儀，張 昂,*

（1.商洛學(xué)院健康管理學(xué)院，陜西 商洛 726000；2.秦皇島出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，河北 秦皇島 066004；3.商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000）

顏色是反映葡萄酒品質(zhì)的重要屬性，可以提供葡萄酒類型、陳釀時間等相關(guān)信息，會對消費者的選擇和認(rèn)知產(chǎn)生影響[1-2]。研究紅葡萄酒中花色素及葡萄酒顏色參數(shù)之間的聯(lián)系，對影響葡萄酒呈色的化學(xué)成分及原因進行理論分析，可以為紅葡萄酒釀制的工藝優(yōu)化、品質(zhì)分析、質(zhì)量控制及其他相關(guān)基礎(chǔ)研究提供一定理論依據(jù)。

花色素是產(chǎn)生葡萄酒顏色變化的基礎(chǔ)物質(zhì)，其含量和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性對葡萄酒感官品質(zhì)具有重要影響[3-4]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者從不同角度對葡萄酒中花色素及其與葡萄酒顏色之間的關(guān)系進行了研究。張波等[5-6]論述了紅葡萄酒中主要花色素以及衍生物的結(jié)構(gòu)特征、形成途徑和理化性質(zhì)，并對葡萄酒中花色素輔色化作用等進行了系統(tǒng)介紹。梁娜娜等[7]分析了6 種葡萄酒中花色素含量與葡萄酒顏色參數(shù)間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)不同花色素對不同葡萄酒顏色參數(shù)具有一定影響。蘭圓圓等[8]對21 款不同品種和年份的干紅葡萄酒進行分析，研究了總花色素、總酚含量和顏色參數(shù)之間的聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)總花色素含量與葡萄酒顏色深度等顏色參數(shù)具有顯著相關(guān)性。葛謙等[9]分析了葡萄酒釀造過程中6 種花色素單體、花色素含量與葡萄酒顏色參數(shù)的變化規(guī)律。Sáenz-Navajas等[10]研究分析了西班牙58 份市售橡木紅葡萄酒樣本中花色素組成與顏色參數(shù)之間的聯(lián)系。

目前國際上進行顏色評價的方法體系主要有RGB色空間[11]、孟塞爾色彩體系[12]、CIELUV色空間[13]和CIELAB色空間[14]。其中只有CIELAB色空間與人眼色刺激值感官相符，被廣泛應(yīng)用于食品及葡萄酒的相關(guān)研究[15-16]。國家質(zhì)檢總局認(rèn)定的方法[17-18]中均使用該體系進行顏色評價。

本研究采集119 種紅葡萄酒為供試樣品，對其CIELAB顏色參數(shù)、16 種常見單體花色素含量[19]及總花色素含量進行大樣本檢測分析，通過主成分分析、相關(guān)分析及多元線性回歸分析尋找參數(shù)間相關(guān)聯(lián)系，以期為進一步有針對性開展紅葡萄酒輔色研究及品質(zhì)優(yōu)化提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售119 種紅葡萄酒。

乙腈（色譜純） 美國Fisher公司；濃鹽酸、冰醋酸（均為分析純） 天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；乙酸鈉、氯化鉀（均為分析純） 天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；花色素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.5%）：飛燕草色素（delphinidin，Del）、飛燕草素-3-葡萄糖苷（delphinidin-3-glucoside，Del-3-G）、飛燕草素-3,5-二葡萄糖苷（delphinidin-3,5-diglucoside，Del-3,5-D）、飛燕草素鼠李葡萄糖苷（delphinidin-3-O-rutinoside，Del-3-R）、矢車菊素（cyanidin，Cya）、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-glucoside，Cya-3-G）、矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷（cyanidin-3,5-diglucoside，Cya-3,5-D）、天竺葵色素苷（pelargonin，Pel）、芍藥素（peonidin，Peo）、芍藥苷-3-葡萄糖苷（peonidin-3-O-glucoside，Peo-3-G）、芍藥素3,5-二葡萄糖苷（peonidin-3,5-di-O-glucoside，Peo-3,5-D）、錦葵色素（malvidin，Mal）、錦葵色素-3,5-二葡萄糖苷（malwidin-3,5-diglucoside，Mal-3,5-D）、錦葵色素-3-半乳糖苷（malvidin-3-galactoside，Mal-3-G）、矮牽牛素（petunidin，Pet）、矮牽牛素-3-葡萄糖苷（petunidin-3-O-β-D-glucoside，Pet-3-G） 美國Extrasynthese SA公司。

1.2 儀器與設(shè)備

NEXERA LC-30AD液相色譜儀、UV-2550紫外分光光度計 日本島津公司；QTRAP 4500質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源、Turbo V離子源和Analyst1.5數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）美國AB Sciex公司；W100葡萄酒顏色測定儀 濟南海能儀器股份有限公司；410C-01A酸度計 美國ORION公司；Milli-Q去離子水機 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 Lab色空間參數(shù)的測定

將酒樣取上清液過0.45 μm水性濾膜加入10 mm比色皿中，利用葡萄酒顏色測定儀直接測定L*、a*值和b*值[20]。葡萄酒顏色測定儀內(nèi)置D65光源，10°觀察角，CIE1976LAB色空間計算體系。

1.3.2 酒樣中總花色素含量、pH值的測定

總花色素含量測定采用pH示差法[21]。用氯化鉀和鹽酸配制pH 1.0的緩沖液，用三水合乙酸鈉和乙酸配制pH 4.5的緩沖液，取0.5 mL酒樣分別用pH 1.0的緩沖液和pH 4.5的緩沖液定容至10 mL，室溫平衡100 min，再將2 份不同pH值緩沖液稀釋的酒樣分別置于波長510 nm和700 nm條件下測吸光度，根據(jù)pH示差法公式計算總花色素含量，以天竺葵色素-3-葡萄糖苷含量計。

pH值采用酸度計直接測定。

1.3.3 單體花色素含量的測定[22-23]

色譜條件：柱溫40 ℃，進樣體積30 μL，流速0.25 mL/min，用Phenyl-Hexyl色譜柱分離，根據(jù)花色素單體性質(zhì)確定流動相A：含5%甲醇的1%甲酸溶液，流動相B：1%甲酸-甲醇溶液。洗脫程序：0～3.1 min，0%～65% B；3.1～8.0 min，65% B；8.0～8.5 min，65%～100% B；8.5～12.5 min，100% B；12.5～13 min，100%～0% B；13～20 min，0% B。

質(zhì)譜條件：電霧噴離子源，正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測，質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 000；霧化器壓力345 kPa；輔助氣流速10 L/min；干燥氣溫度350 ℃；氣簾氣壓力30 psi；離子噴霧電壓5 500 V；離子源溫度500 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 19.0軟件對酒樣中所有變量進行主成分分析，進行各變量與L*、a*、b*值之間相關(guān)性分析，并對紅葡萄酒CIELAB色空間參數(shù)與花色素含量進行相關(guān)多元線性回歸分析[24]。

外標(biāo)法計算單體花色素含量[25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄酒樣品中CIELAB色空間參數(shù)和花色素含量描述性統(tǒng)計分析

按照1.3節(jié)方法對采集的119 種紅葡萄酒樣品進行測定。得到上述樣本的CIELAB色空間參數(shù)、16 種單體花色素含量、總花色素含量和pH值等檢測值，對其進行描述性統(tǒng)計分析，結(jié)果如表1所示。

表1 紅葡萄酒樣本中CIELAB色空間參數(shù)和花色素含量描述統(tǒng)計結(jié)果Table 1 Descriptive statistics for the CIELAB color parameters and anthocyanins in red wine samples

2.2 葡萄酒樣品中顏色指標(biāo)變量的主成分分析

表2 紅葡萄酒樣本中顏色指標(biāo)各主成分的特征值和累計貢獻(xiàn)率Table 2 Characteristic values and cumulative contribution of principal components of color attributes in wine samples

主成分分析目的在于利用原變量間相關(guān)性較強的特點，降低數(shù)據(jù)維度，用較少的指標(biāo)盡可能多地反映原數(shù)據(jù)信息[26]。為探尋不同單體花色素含量、總花色素含量及pH值對紅葡萄酒顏色的貢獻(xiàn)差異，本研究利用SPSS 19.0軟件對采集的119 種紅葡萄酒樣品中顏色指標(biāo)檢測數(shù)據(jù)進行Z得分標(biāo)準(zhǔn)化處理后進行主成分分析，如表2所示。主成分分析中貢獻(xiàn)率越大，說明主成分所包含的原始變量信息越強[27]。由表2可知，本研究得到的3 個主成分累計貢獻(xiàn)率達(dá)到84.11%，表明3 個主成分能夠較好反映原始數(shù)據(jù)絕大部分信息。

表3 成分矩陣Table 3 Component matrix

由表3可知，主成分1主要由Del、Del-3-R、Del-3-G、Mal、Mal-3-G、Cya、Cya-3-G、Cya-3,5-D、Peo、Peo-3-G、Peo-3,5-D、Pet、Pet-3-G含量和總花色素含量14 種相關(guān)程度較高的變量構(gòu)成，其因子相關(guān)程度在0.821～0.989之間，相關(guān)程度最高的變量為Pet含量和總花色素含量。主成分2主要由L*值與a*值2 個相關(guān)程度較高的變量構(gòu)成，因子相關(guān)程度分別為0.830與-0.831。主成分3中無相關(guān)程度較高的變量。由圖1可知，119 種紅葡萄酒樣品在空間排布上具有較大差異性，可以通過主成分得分圖，直觀將其分類。第1分類包括41 種樣品，第2分類包括57 種樣品，第3分類包括21 種樣品。

圖1 花色素、pH值及CIELAB參數(shù)值主成分得分圖Fig. 1 Score plot of the fi rst three principal components for anthocyanins, pH value and CIELAB parameters

2.3 葡萄酒樣品中顏色指標(biāo)變量的相關(guān)性分析

表4 相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis

由表4可知，明亮度L*值與a*值、Cya-3-G、Peo-3-G、Peo含量和pH值極顯著相關(guān)，與Pet-3-G和Mal-3,5-D含量顯著相關(guān)，除pH值、Peo-3,5-D、Pel和Mal-3,5-D含量以外均呈負(fù)相關(guān)。a*值與Cya-3-G、Pet-3-G、Peo、Peo-3-G含量和pH值極顯著相關(guān)，與Pet、Cya、Del-3-G、Del、Del-3-R含量顯著相關(guān)。其中，a*值與b*值、Mal-3,5-D、Pel、Cya-3-G含量和pH值呈負(fù)相關(guān)，與其余變量均呈正相關(guān)。b*值與Peo-3,5-D、Del-3-R、Pet、Pet-3-G、Cya-3-G、Mal、Peo-3-G、Mal-3-G、Peo、Cya、Cya-3,5-D、Del-3-G、Del含量和單體花色素總計極顯著相關(guān)，與Del-3,5-D、Mal-3,5-D含量顯著相關(guān)，且均呈負(fù)相關(guān)?？偦ㄉ睾颗cL*、a*、b*值均極顯著相關(guān)。其中與a*值呈正相關(guān)，與L*、b*值呈負(fù)相關(guān)。

在CIELAB體系中，L*值代表亮度（L*=0黑色，L*=100無色），a*值代表紅/綠顏色分量（a*＞0與紅色相關(guān)，a*＜0與綠色相關(guān)），b*值代表藍(lán)/黃顏色分量（b*＞0與黃色相關(guān)，b*＜0與藍(lán)色相關(guān)），a*、b*值與顏色的強度高低及顏色飽和度相關(guān)。通過上述相關(guān)性分析可知，紅葡萄酒顏色越向紅色方向偏移明亮度越低，增加Pet-3-G、Cya-3-G、Peo-3-G、Peo含量和總花色素含量將導(dǎo)致紅葡萄酒顏色變暗。增加Cya-3-G含量，提升pH值將使紅葡萄酒顏色向綠色方向偏移，增加Pet-3-G、Peo、Peo-3-G含量和總花色素含量則使紅葡萄酒顏色向紅色方向偏移。增加Peo-3,5-D、Del-3-R、Pet、Pet-3-G、Cya-3-G、Mal、Peo-3-G、Mal-3-G、Peo、Cya、Cya-3,5-D、Del-3-G、Del、Del-3,5-D、Mal-3,5-D含量和總花色素含量，將使紅葡萄酒顏色向藍(lán)色方向偏移。其中，總花色素含量對紅葡萄酒明亮度、紅綠色調(diào)、黃藍(lán)色調(diào)均具有顯著影響。單體花色素中，Cya-3-G含量對紅葡萄酒明亮度和紅綠色調(diào)影響最為顯著，Mal含量對黃藍(lán)色調(diào)影響最為顯著。

2.4 葡萄酒樣品中顏色指標(biāo)變量多元線性回歸模型的建立

表5 模型匯總與方差分析Table 5 Model parametersand analysis of variance

分別以L*、a*、b*值為因變量，以16 種單體花色素含量為自變量，使用SPSS 19.0軟件建立多元線性回歸模型[28]，模型擬合情況如表5所示。模型A復(fù)相關(guān)系數(shù)R為0.532，調(diào)整后的判定系數(shù)R2為0.172；模型B復(fù)相關(guān)系數(shù)R為0.557，調(diào)整后的判定系數(shù)R2為0.203；模型C復(fù)相關(guān)系數(shù)R為0.531，調(diào)整后的判定系數(shù)R2為0.170；當(dāng)DW≈2時判斷殘差獨立。根據(jù)模型F值統(tǒng)計量的觀察值和概率P值可以判斷，在0.01水平下認(rèn)為L*、a*、b*值和自變量之間有線性關(guān)系（F＞Fa），從R2擬合優(yōu)度判斷，模型B的擬合度優(yōu)于模型A和模型C，各解釋變量對因變量有顯著影響[29]。

從表5可知，模型A、模型B和模型C的回歸平方和分別為1 467.298、1 306.815和1 015.693，殘差平方和分別為3 712.350、2 901.813和2 593.057，因此線性回歸模型只解釋部分總平方和，由于3 個模型的顯著性檢驗值均小于0.01，可判斷花色素含量與葡萄酒顏色之間存在著線性關(guān)系，線性關(guān)系強弱需進一步進行分析。

表6 多元線性回歸系數(shù)Table 6 Multiple linear regression coefficients

在顯著性0.10水平下剔除不符合顯著性要求的變量，得到多元線性回歸系數(shù)列表，如表6所示。根據(jù)模型A、B、C的對應(yīng)系數(shù)得到模型預(yù)測方程：L*=58.208-1.742×Pet-3-G，a*=36.619+1.716×Pet-3-G，b*=27.819+0.653×Cya。根據(jù)容差和方差膨脹因子（variance inflation factor，VIF）判斷建立的模型C共線性不明顯（VIF＜20），模型A和模型B共線性明顯（VIF＞20），可能是樣本容量小導(dǎo)致。

圖2 L*（A）、a*（B）、b*值（C）回歸標(biāo)準(zhǔn)化殘差直方圖和標(biāo)準(zhǔn)化正態(tài)P-P圖Fig. 2 Standardized residual histogram and normal P-P plot for L*value (A), a* value (B) and b* value (C)

對建立的3 個模型殘差統(tǒng)計量進行分析，如圖2所示。3 個模型的標(biāo)準(zhǔn)化殘差基本呈正態(tài)分布，散點分布靠近直線，具有良好的方差齊性和正態(tài)性。

3 結(jié)論與討論

本研究通過采集并分析119 種市售紅葡萄酒樣本中的顏色相關(guān)指標(biāo)，通過主成分分析得到對紅葡萄酒顏色貢獻(xiàn)程度較大的3 個主成分，累計貢獻(xiàn)率為84.11%。并得到16 種相關(guān)程度較高的變量因子。單體花色素中，Pet含量的相關(guān)程度最高，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.989。通過相關(guān)性分析得知總花色素含量對紅葡萄酒明亮度、紅綠色調(diào)、黃藍(lán)色調(diào)均有顯著影響。單體花色素中，Cya-3-G含量對紅葡萄酒明亮度和紅綠色調(diào)影響最為顯著，Mal含量對黃藍(lán)色調(diào)影響最為顯著。進一步通過多元線性回歸分析可知，以L*、a*、b*值為因變量，以對應(yīng)顯著相關(guān)的變量為自變量，建立多元線性回歸模型，可在一定程度上解釋自變量反映因變量的變化，其中Pet-3-G含量對L*、a*最終值影響顯著，Cya含量對b*值最終值影響顯著。

Rivas[30]和Czibulya[31]等研究發(fā)現(xiàn)紅葡萄酒最終呈色受多種因素影響，邊緣色調(diào)主要由黃藍(lán)色調(diào)決定，Sáenz-Navajas等[10]研究結(jié)果證明吡喃類花色素（Pet-3-G等）對葡萄酒中紅綠色和明亮度影響顯著，與本研究分析結(jié)果相符。同時，本研究通過統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)除Pel外其他15 種花色素對紅葡萄酒黃藍(lán)色調(diào)均有顯著影響。

本研究結(jié)果說明綜合利用主成分分析、相關(guān)性分析和多元線性回歸分析3 種方法，可對紅葡萄酒樣本中不同種類單體花色素含量、總花色素含量、pH值與CIELAB色空間體系參數(shù)的關(guān)系進行分析，并通過建立數(shù)學(xué)模型對花色素等多酚類化合物對葡萄酒顏色的影響進行客觀解釋。由于研究時間、手段特別是樣本種類數(shù)量的限制，本實驗對上述成分對葡萄酒顏色的具體影響分析尚不夠深入，需在后續(xù)研究中進一步加大采樣種類數(shù)量、豐富研究方法，對紅葡萄酒中不同成分對葡萄酒顏色的具體影響進行進一步研究確認(rèn)。