王淑娟，劉 程，方水琴，田亞晨，董慶利，王 翔，許東坡,*，劉 箐,2,*

（1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室，海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室，山東 青島 266071）

大腸桿菌O157:H7（Escherichia coli O157:H7）屬革蘭氏陰性桿菌，是最常見的食源性致病菌之一，在世界范圍內(nèi)普遍存在，廣泛分布于土壤、水和食物中[1]。它是出血性結(jié)腸炎和溶血性尿毒癥綜合征的主要致因[2]。該菌引起的發(fā)病率高，低至100 個大腸桿菌O157:H7細(xì)胞可引起易感病人腸道內(nèi)的病原體生長，產(chǎn)生志賀毒素[3]。因此對大腸桿菌O157:H7的高靈敏度、快速和選擇性檢測對預(yù)防疾病爆發(fā)，保障食品安全和人體健康具有重要意義。

目前，大腸桿菌O157:H7最常用的檢測方法包括傳統(tǒng)培養(yǎng)法、酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[4]和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）[5]。傳統(tǒng)培養(yǎng)法包括預(yù)富集、選擇性富集、生化篩選和血清學(xué)確認(rèn)，費時費力[6]。PCR等分子方法雖然靈敏度高，能實現(xiàn)快速檢測[7]，但通常需要DNA提取等樣品預(yù)處理步驟，且聚合酶易被某些樣品成分抑制，有樣品交叉污染的風(fēng)險，限制了其在發(fā)展中國家的應(yīng)用[8]。免疫學(xué)分析取決于抗原和抗體之間的特定相互作用，此類用于檢測大腸桿菌O157:H7的方法有電致化學(xué)發(fā)光傳感器[9]、電化學(xué)生物傳感器[10]、熒光生物傳感器[11]、化學(xué)傳感器[12]等，這些方法處理簡單、分析時間短、靈敏度高，在實際應(yīng)用中具有良好的潛力。

常規(guī)ELISA中，通常采用堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）催化底物產(chǎn)生檢測信號。該方法的靈敏度低且需預(yù)增菌等步驟，整個檢測過程長達(dá)7 h。HRP作為催化劑有很多的局限性，如熱穩(wěn)定性差、純化時間長、成本高、最佳pH值范圍窄，且對大多數(shù)有機(jī)溶劑和金屬離子的耐受性低等[13]。這些內(nèi)在缺陷極大地阻礙了天然酶的實際應(yīng)用。解決這一問題的方法是構(gòu)建更穩(wěn)定、更容易獲取的仿生酶，包括貴金屬及其合金、環(huán)糊精、金屬有機(jī)骨架等。金屬有機(jī)骨架材料是利用各種金屬離子和有機(jī)連接體設(shè)計的一類先進(jìn)的具有高孔隙率的晶體材料。因其具有熱穩(wěn)定性、離散結(jié)構(gòu)有序、密度低、比表面積大（超過6 000 m2/g）、易于合成以及適用于物理和化學(xué)應(yīng)用的廣譜特性，在氣體儲存或分離[14]、藥物運輸[15]、催化[16]等領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注。目前報道已經(jīng)有20 000 個金屬有機(jī)骨架材料具有催化性能[17]，如MIL-68、MIL-100、Cu-MOF等。如Zhang Jianwei等[18]發(fā)現(xiàn)兩種Fe（III）基金屬有機(jī)骨架具有類似于過氧化物酶的作用，利用這一特性建立了一種簡單、高靈敏度的比色法檢測過氧化氫（H2O2）和抗壞血酸。Wang Shuqin等[19]合成了Cu-MOF材料經(jīng)戊二醛活化后與金黃色葡萄球菌適配體結(jié)合，利用Cu-MOF的催化性能檢測牛奶中的金黃色葡萄球菌，檢測范圍為50～10 000 CFU/mL，檢測限為20 CFU/mL。

本實驗以大腸桿菌O157:H7為檢測對象，結(jié)合金屬有機(jī)骨架材料（ZIF-67）的催化性能，替代傳統(tǒng)的HRP對抗體進(jìn)行標(biāo)記，并通過磁性微球富集目標(biāo)物，建立一種新型的基于雙抗體夾心法的牛奶中大腸桿菌O157:H7的快速定量檢測方法。該方法旨在嘗試將金屬有機(jī)骨架材料與食源性致病菌檢測相結(jié)合，建立食源性致病菌檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蒙牛利樂包牛奶 市購。

大腸桿菌O157:H7（ATCC43895）、單核細(xì)胞增生李斯特菌（ATCC43251）、鼠傷寒沙門氏菌（CMCC（B）50115）、大腸埃希氏菌（ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC29213）均為本實驗室保藏。

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、大腸桿菌O 1 5 7:H 7顯色培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；CoCl2-6H2O、3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）、30% H2O2、氫氧化鈉（NaOH）、無水乙醇、濃硫酸、50%戊二醛 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氨基功能化磁性微球（Fe3O4-NH2，200 nm） 阿拉丁試劑公司；2-甲基咪唑阿達(dá)瑪斯試劑公司；HRP、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） Sigma-Aldrich（上海）貿(mào)易有限公司；大腸桿菌O157:H7多克隆抗體和單克隆抗體（D3）由本實驗室自制，效價分別為1∶8 000和1∶64 000。

1.2 儀器與設(shè)備

ZD-600加熱攪拌器 上海實驗儀器廠有限公司；SpectraMaxM2酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司；Philips XL30掃描電鏡（scanning electronic microscopy，SEM） 荷蘭Netherlands公司；D4 X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）儀 德國Bruker公司；Electron Nicolet 380傅里葉變換紅外光譜 美國Thermo公司；DHG-9203A烘箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；5810R高速離心機(jī) 艾本德中國有限公司；7100恒溫水浴鍋日本日立公司；BSC-1600IIA2生物安全柜 蘇凈科學(xué)器材有限公司。

1.3 方法

1.3.1 ZIF-67的合成

Bola型兩親性表面活性劑依據(jù)文獻(xiàn)[20]合成。ZIF-67的合成方法參照Pan Yong等[21]并加以改進(jìn)，具體方法如下：稱取0.056 g Bola型兩親性表面活性劑溶于400 mL水中，80 ℃分散溶解，加入1.64 g 2-甲基咪唑，4.74 g CoCl2·6H2O，繼續(xù)攪拌反應(yīng)4 h，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)離心分離后乙醇和水洗滌3 遍，70 ℃烘箱干燥12 h。

1.3.2 ZIF-67的表征

XRD分析可獲得ZIF-67的晶體結(jié)構(gòu)，該掃描條件為電壓40 kV、電流40 mA、掃描范圍10°～80°、步寬0.02°、掃描速率10°/s；以掃描電子顯微鏡研究ZIF-67的形貌、結(jié)構(gòu)以及顆粒大小等，加速電壓20 kV，樣品室真空度小于2.7×10-5Pa。

1.3.3 ZIF-67類過氧化物酶性能分析

以H2O2為底物，TMB為供氫體，濃硫酸為反應(yīng)終止液，檢測A450nm，比較0.5 mg/mL HRP與1 mg/mL ZIF-67的催化性能。

1.3.4 溫度、pH值、反應(yīng)時間、TMB濃度對ZIF-67催化性能的影響

為研究ZIF-67納米粒子的催化作用，對溫度（4、25、37、40、50、60、70、80 ℃）、pH值（0.1 mol/L NaOH，蒸餾水，0.5、1、2 mol/L H2SO4）、反應(yīng)時間（0、5、10、15、20、25、30、35、40、45 min）、TMB濃度（50、100、150、200、250、300、350、400、500 μmol/L）進(jìn)行研究。進(jìn)行單因素研究時，保證其他條件一致。稱取0.05 g ZIF-67溶解于100 mL蒸餾水中，超聲溶解，配制成0.5 mg/mL的ZIF-67溶液。于常溫下保存待用。反應(yīng)后的溶液在離心管中混勻后轉(zhuǎn)移至96 孔酶標(biāo)板中，每孔加200 μL，測定A450nm。每個處理2 個平行。

1.3.5 細(xì)菌的培養(yǎng)

將大腸桿菌O157:H7（ATCC 43895）、單核細(xì)胞增生李斯特菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌分別接種于20 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h，取1 mL菌液，8 000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀用1 mL無菌磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS，pH 7.4）重懸。用無菌PBS將重懸后的大腸桿菌O157:H7純菌液進(jìn)行10 倍系列稀釋。

1.3.6 Fe3O4-NH2與大腸桿菌O157:H7多克隆抗體的結(jié)合

采用戊二醛活化法對材料進(jìn)行活化，具體方法如下：稱取0.1 g氨基功能化磁性微球用0.01 mol/L的PBS沖洗3 遍后，分散于含20 mL 0.01 mol/L PBS（pH 7.4）的50 mL離心管中，加入50%戊二醛使其最終質(zhì)量濃度為1.25 g/100 mL，37 ℃搖床活化2 h后，用磁鐵完全吸附后倒去上清液，沉淀用無菌水沖洗3 次，以去除殘留的戊二醛；隨后，加入10 mg大腸桿菌O157:H7多克隆抗體，混合物在4 ℃搖晃24 h后用磁鐵完全吸附Fe3O4-NH2-抗體復(fù)合物后倒掉上清液，以去除多余未結(jié)合的抗體。然后，用1% BSA重懸Fe3O4-NH2-抗體復(fù)合物后在4 ℃封閉2 h，以避免非特異性吸附。最后，通過磁鐵吸附、無菌水沖洗等步驟后，重懸于10 mL 0.01 mol/L PBS（pH 7.4）中，放置4 ℃保存。

1.3.7 ZIF-67與大腸桿菌O157:H7單克隆抗體D3結(jié)合

同樣采用戊二醛活化法，稱取0.06 g ZIF-67用0.01 mol/L的PBS沖洗3 遍，經(jīng)8 000 r/min離心5 min后，分散于含20 mL 0.01 mol/L PBS（pH7.4）的50 mL離心管中，加入50%戊二醛使其終質(zhì)量濃度為1.25 g/100 mL，37 ℃搖床活化2 h。活化后的ZIF-67經(jīng)8 000 r/min離心5 min棄掉上清液，沉淀用無菌水沖洗3 次，以去除殘留的戊二醛；隨后，加入4 mg大腸桿菌O157:H7單克隆抗體（D3），混合物在4 ℃攪拌24 h，反應(yīng)產(chǎn)物在4 000 r/min離心10 min以去除多余的抗體。然后，用1% BSA 4 ℃封閉2 h，以避免非特異性吸附。最后，通過離心、水沖洗后，重懸于10 mL 0.01 mol/L PBS（pH 7.4）中，放置4 ℃保存。

1.3.8 細(xì)菌培養(yǎng)及計數(shù)

將凍存在-80 ℃的甘油菌經(jīng)2 次活化后，按1∶100的比例轉(zhuǎn)接到20 mL新鮮的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置于37 ℃搖床培養(yǎng)過夜。

計數(shù)方法：在生物安全柜中，從上述菌液中吸取100 μL加到含900 μL的無菌PBS的離心管中，振蕩數(shù)秒計為10-1倍稀釋，按照此方式，依次進(jìn)行10 倍稀釋分別計為10-2、10-3、10-4、10-5、10-6混勻后分別吸取100 μL涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上，每個稀釋度作3 次平行。倒置后于37 ℃培養(yǎng)48 h。按照GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》方法進(jìn)行菌落計數(shù)。

1.3.9 新型基于ZIF-67的雙抗體夾心法在食品中大腸桿菌O157:H7的實際檢測

在1.5 mL離心管中依次加入100 μL Fe3O4-NH2-多抗、100 μL ZIF-67-D3和50 μL大腸桿菌O157:H7（101、102、103、104、105、106、107、108CFU/mL），混勻后在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min。反應(yīng)結(jié)束后用磁鐵吸附2 min后棄去上清液，并用0.01 mol/L無菌PBS進(jìn)行清洗3 次并棄掉上清液；然后分別依次在離心管中加入100 μL 0.5 mmol/L TMB和100 μL 1 mol/L H2SO4；混勻并用磁鐵吸附2 min后吸取200 μL上清液至96 孔酶標(biāo)板中，置于SpectraMax M2酶標(biāo)儀中讀取A450nm；以A450nm為縱坐標(biāo)，大腸桿菌O157:H7濃度為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以0.01 mol/L PBS為空白對照得到A0，濃度梯度的大腸桿菌O157:H7得到A，最后結(jié)果以A-A0計算得到線性方程，并計算R2值。

1.3.10 方法的特異性及實際應(yīng)用研究

將凍存在-80 ℃的甘油菌（大腸桿菌O157:H7（ATCC 43895）、大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌及金黃色葡萄球菌）經(jīng)2 次活化后，按1∶100的比例轉(zhuǎn)接到20 mL新鮮的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置于37 ℃搖床培養(yǎng)過夜。經(jīng)平板計數(shù)后分別將5 種菌懸液稀釋至106CFU/mL。100 μL Fe3O4-NH2-多抗、100 μL ZIF-67-D3和50 μL上述菌懸液（106CFU/mL），以無菌PBS作陰性對照，按照1.3.9節(jié)中的方法進(jìn)行顯色和計算。最后結(jié)果以A-A0計算作圖，驗證其特異性。

1.3.11 人工污染牛奶樣品的檢測

將大腸桿菌O157:H7人工接種到牛奶中，制備成人工污染的牛奶樣品，濃度為3.3×102～3.3×105CFU/mL。按照上述方法進(jìn)行吸光度的檢測，以無菌牛奶做陰性對照，每個濃度分別用該方法和大腸桿菌O157:H7顯色平板計數(shù)法做3 次重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

ZIF-67 XRD結(jié)果和傅里葉紅外光譜結(jié)果導(dǎo)出txt文檔后采用Graph Pad軟件進(jìn)行繪制。其余結(jié)果均通過Graph Pad軟件繪制完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZIF-67的合成與結(jié)果

圖1 ZIF-67的SEM圖譜（a）和XRD圖譜（b）Fig. 1 SEM (a) and XRD (b) profile of ZIF-67

合成的ZIF-67為綠色粉末，SEM圖譜（圖1a）ZIF-67為規(guī)則的納米薄片，尺寸約500 nm，XRD（圖1b）結(jié)果表明ZIF-67的結(jié)晶度較好，和文獻(xiàn)[21]中合成的ZIF-67出峰位置一致，說明ZIF-67合成成功。

2.2 ZIF-67與HRP催化性能的比較

如圖2所示，H2O2存在時，ZIF-67和HRP都可以催化TMB顯色，說明ZIF-67具有過氧化物酶樣催化性能。而在H2O2不存在時，HRP不能催化TMB顯色，而ZIF-67依然可以催化TMB顯色，對此現(xiàn)象的解釋為金屬有機(jī)骨架材料能夠提供具有活性金屬中心的非常高的表面積，確保了在活性金屬中心的情況下，氧氣容易進(jìn)入，從而發(fā)揮其催化作用[19,22]。

2.3 溫度、pH值、反應(yīng)時間、TMB濃度對ZIF-67催化性能的影響

ZIF-67催化TMB顯色不需要H2O2即可完成，所以不再討論H2O2濃度對其催化性能的影響。如圖3所示，ZIF-67催化反應(yīng)最佳條件為室溫、200 μmol/L TMB、0.5 mol/L硫酸終止液，且該催化作用不受時間的限制?；谝陨献罴逊磻?yīng)條件，以ZIF-67濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明ZIF-67自身線性良好，R2為0.994 7。

圖3 反應(yīng)條件對ZIF-67催化性能的影響Fig. 3 Effect of reaction conditions on catalytic performance of ZIF-67

2.4 定量檢測大腸桿菌O157:H7方法的建立

由于氨基功能化磁性微球本身在無H2O2時不可催化TMB顯色，所以本實驗通過沉淀顯色法：即通過氨基功能化磁性微球特異性富集大腸桿菌O157:H7后，檢測與其結(jié)合的ZIF-67的量，從2.3節(jié)可知，ZIF-67本身線性良好，說明可以通過ZIF-67的量間接檢測大腸桿菌O157:H7的量。通過上述方法，以大腸桿菌O157:H7濃度為橫坐標(biāo)，A-A0為縱坐標(biāo)，建立大腸桿菌O157:H7濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)曲線。大腸桿菌O157:H7的檢測線性濃度范圍為17～1.7×108CFU/mL（平板計數(shù)結(jié)果）。檢測限通過計算3σ[23]（σ為空白樣品測量的標(biāo)準(zhǔn)偏差）為17 CFU/mL。R2為0.990 6，說明該方法可以用于大腸桿菌O157:H7的定量檢測，且線性結(jié)果良好。

2.5 人工污染牛奶中大腸桿菌O157:H7檢測及方法的特異性

對人工污染大腸桿菌O157:H7的牛奶樣品，選取4 個稀釋度（3.3×102～3.3×105），按照上述方法進(jìn)行檢測，與大腸桿菌O157:H7顯色平板上的檢測結(jié)果進(jìn)行對比，表1表明，該方法的檢測結(jié)果與平板計數(shù)結(jié)果一致，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.73%～11.4%，回收率為100%～105%。而且與常見的食源性致病菌（鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、沙門氏菌、大腸埃希氏菌）進(jìn)行對比（圖4），該方法的特異性強(qiáng)。

表1 人工污染牛奶樣品中大腸桿菌O157:H7的檢測Table 1 Detection of E. coli O157:H7 in real milk samples

圖4 特異性分析Fig. 4 Analysis of specificity

2.6 與其他檢測大腸桿菌O157:H7方法的比較

與其他方法相比（表2），本實驗中的新型基于ZIF-67催化顯色的免疫學(xué)方法檢測大腸桿菌O157:H7的檢測范圍寬，檢測限和PCR及其他高靈敏度傳感器檢測方法一致，且不需任何昂貴的儀器設(shè)備，操作簡單、檢測時間短、無需樣品前增菌和預(yù)富集。

表2 與其他檢測大腸桿菌O157:H7方法的比較Table 2 Comparison of this method with other methods for detection of E. coli O157:H7

3 結(jié) 論

本研究建立了一種基于金屬有機(jī)骨架材料（ZIF-67）催化性能的快速檢測牛奶中大腸桿菌O157:H7的方法。該方法的檢測范圍為17～1.7×108CFU/mL，檢測限為17 CFU/mL。該方法是通過檢測與大腸桿菌O157:H7結(jié)合的ZIF-67的量間接確定細(xì)菌數(shù)量的定量檢測，檢測過程可在1 h內(nèi)完成。和其他檢測方法相比，無需昂貴儀器及對樣品的前處理。因此，該方法是一種特異性高、快速、靈敏度高的雙抗體夾心免疫學(xué)檢測方法，為大腸桿菌O157:H7的快速檢測開辟了新途徑，在食品檢測領(lǐng)域具有很好的發(fā)展前景。