陳巍，李華麗，邱金龍

異源表達(dá)古菌TRAM基因增強(qiáng)水稻的耐旱性

陳巍1, 2，李華麗1，邱金龍1

1 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，北京 100101 2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

干旱會(huì)直接影響水稻的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致其產(chǎn)量和品質(zhì)下降。在水稻中異源表達(dá)細(xì)菌RNA分子伴侶Csp能夠顯著提高水稻的耐旱能力，并且不影響水稻的正常生長(zhǎng)。古菌中也發(fā)現(xiàn)具有類似細(xì)菌分子伴侶Csp功能的TRAM (TRM2 and MiaB) 蛋白，且古菌的DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯等過(guò)程與真核生物有著更為相似的調(diào)控方式，然而，古菌中RNA分子伴侶蛋白能否調(diào)控植物耐旱能力還未見(jiàn)報(bào)道。我們選取了嗜冷甲烷古菌R15中兩個(gè)TRAM蛋白在水稻中進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在水稻中過(guò)量表達(dá)Mpsy_3066和Mpsy_0643兩個(gè)TRAM蛋白均能顯著提高水稻苗期和成株期時(shí)對(duì)干旱脅迫的耐受能力。同時(shí)，我們?cè)谒驹|(zhì)體中驗(yàn)證了TRAM蛋白可以發(fā)揮其分子伴侶的功能消除RNA的錯(cuò)誤折疊對(duì)翻譯的影響，這可能是TRAM轉(zhuǎn)基因植物發(fā)揮其耐旱能力的作用機(jī)制。該工作初步展示了異源表達(dá)古菌TRAMs可以作為提高水稻耐旱能力的一種有效手段。

水稻，干旱脅迫，RNA分子伴侶，古菌，TRAM

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，為世界上超過(guò)一半的人口提供了主糧[1]。然而水稻的生長(zhǎng)發(fā)育需要大量的水分供給，干旱或者供水不足會(huì)對(duì)水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生巨大的影響[2]。特別是近年來(lái)全球氣候變暖，年降水量不穩(wěn)定且分布不均，對(duì)農(nóng)業(yè)用水特別是水稻等農(nóng)作物的灌溉用水造成了一定的壓力，威脅著糧食安全[3]。因此，提高水稻的抗旱能力是促進(jìn)糧食增產(chǎn)的一個(gè)有效途徑。植物在干旱脅迫下會(huì)發(fā)生一系列的生理應(yīng)激反應(yīng)，包括氣孔開(kāi)度變化、胞內(nèi)活性氧清除酶的合成、滲透調(diào)節(jié)小分子物質(zhì)(例如可溶性糖、甘氨酸、脯氨酸) 的積累、葉片卷曲以及葉表面角質(zhì)層加厚等[4]。基于基因工程的方法將干旱脅迫相關(guān)基因編輯使之功能失活或向植物基因組中導(dǎo)入外源基因以得到穩(wěn)定表達(dá)的植株，也可增強(qiáng)植物抵抗干旱脅迫的耐受性[5]。

轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)調(diào)控對(duì)真核生物的生長(zhǎng)發(fā)育和響應(yīng)外部環(huán)境刺激至關(guān)重要[6-8]。RNA分子伴侶(RNA chaperone) 是一類廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中的RNA結(jié)合蛋白。RNA分子伴侶通過(guò)與非功能性折疊的RNA底物結(jié)合，幫助其重排并形成正確的折疊方式或幫助RNase降解錯(cuò)誤折疊的RNA，完成正常的RNA代謝過(guò)程[9]。在應(yīng)激狀態(tài)下，一些RNA分子伴侶的表達(dá)量會(huì)顯著增加，以此來(lái)幫助生物體更好地應(yīng)對(duì)脅迫[10-11]。在水稻和玉米中表達(dá)細(xì)菌中的RNA分子伴侶蛋白——冷激蛋白(Cold shock protein，Csp) CspA和CspB，可以有效地提高其抗凍、抗旱以及抗高溫的能力[12]。在擬南芥和小麥中表達(dá)密碼子優(yōu)化的CspA和CspB蛋白，也可以提高它們的抵抗干旱和鹽脅迫的能力[13]。在水稻中過(guò)表達(dá)擬南芥RNA伴侶蛋白GRP2和GRP7同樣可以顯著提高干旱條件下水稻的結(jié)實(shí)率，從而提高水稻的產(chǎn)量[14]。DEAD-box RNA解旋酶(DEAD-box RHs) 家族成員也具有RNA分子伴侶活性，擬南芥中該家族成員RH8通過(guò)與PP2CA互作，對(duì)ABA信號(hào)和干旱脅迫反應(yīng)具有重要的調(diào)節(jié)作用[15]。

古菌作為生物學(xué)分類中一個(gè)龐大的分支，其RNA分子伴侶蛋白對(duì)植物耐旱能力的調(diào)控卻沒(méi)有報(bào)道。在古菌DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程中，都可以看到與真核生物更為類似的蛋白結(jié)構(gòu)和調(diào)控方式[16]，且古菌多在極端環(huán)境下生存，其本身即具有更強(qiáng)的耐受性。因此，我們希望在古菌中找到類似細(xì)菌冷激蛋白的RNA分子伴侶，檢測(cè)其是否能使植物具有更好的耐受干旱脅迫的能力。雖然Csp類冷激蛋白在細(xì)菌中分布廣泛，且在同一物種中含有多個(gè)同源蛋白，在古菌中卻鮮有其分布[17]。有趣的是，在古菌中存在一類與冷激蛋白結(jié)構(gòu)類似的蛋白TRAM (TRM2 and MiaB)。TRAM是一類具有RNA結(jié)合功能的相關(guān)結(jié)構(gòu)域的總稱，包括尿嘧啶甲基化酶TRM2和腺嘌呤硫醇化酶MiaB，這類結(jié)構(gòu)域在包括古菌在內(nèi)的多種生物體中普遍存在[18]。TRAM蛋白的三維結(jié)構(gòu)已解析，其由5個(gè)反向平行的β鏈組成寡核苷酸/寡糖結(jié)合折痕區(qū)域(Oligonucleotide/oligosaccharide binding fold，OB-fold)，OB-fold結(jié)構(gòu)域一般由70–150個(gè)氨基酸組成，通常被認(rèn)為與核酸識(shí)別有關(guān)，該結(jié)構(gòu)域家族成員之間序列相似性很低，卻具有多個(gè)相似的結(jié)構(gòu)[19]。Csp類蛋白也是由類似結(jié)構(gòu)域組成且與TRAM具有結(jié)構(gòu)同源性。體內(nèi)和體外的實(shí)驗(yàn)證明，TRAM蛋白同細(xì)菌中Csp蛋白功能相似，可以回補(bǔ)大腸桿菌突變體的冷敏感性。TRAM蛋白與底物RNA的結(jié)合無(wú)明顯序列特異性，且親和能力在微摩爾級(jí)別，這與RNA分子伴侶蛋白相符合，進(jìn)一步說(shuō)明其可能就是存在于古菌中的RNA分子伴侶蛋白[10]。

我們從已知的嗜冷甲烷古菌(R15) 4個(gè)TRAMs基因中選取了2個(gè)可以顯著改善大腸桿菌突變體冷敏感性的TRAM基因和，分別在水稻中進(jìn)行過(guò)量表達(dá)，檢測(cè)了其對(duì)水稻耐受干旱脅迫的影響，并初步探究了其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 水稻轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

在 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中分別獲取噬冷甲烷古菌(M. psychrophilus R15) 中兩個(gè)TRAM蛋白Mpsy_3066 (AFV25265) 和Mpsy_0643 (AFV22852) 的氨基酸序列，參考水稻密碼子偏好性，由南京金斯瑞公司對(duì)其進(jìn)行密碼子優(yōu)化并合成相應(yīng)編碼DNA序列。分別將該序列通過(guò)SpeⅠ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)克隆到雙元表達(dá)載體pCAMBIA2300-Ubi[20]中，以玉米泛素啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)目的基因的表達(dá)，構(gòu)建的載體命名為pC2300-Mpsy-3066和pC2300- Mpsy-0643。電激法將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌AGL1中，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化日本晴水稻(L. ssp.c.v. Nipponbare) 愈傷組織，并在含有 G418 的篩選培養(yǎng)基上篩選得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植物。以上雙元表達(dá)載體由中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育研究所儲(chǔ)成才研究員提供，根癌農(nóng)桿菌菌株AGL1及日本晴野生型水稻由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

取培養(yǎng)14 d的水稻新鮮葉片，在液氮中冷凍后破碎，用CTAB法提取水稻基因組DNA。設(shè)計(jì)引物(表1) 用于插入DNA的擴(kuò)增檢測(cè)，由華大基因合成，稀釋至10 μmol/L。PCR反應(yīng)采用2×PCR StarMix with Loading Dye試劑盒(康潤(rùn)公司)。反應(yīng)體系包括10 μL 2×PCR StarMix、正向及反向引物各1 μL、1 μL DNA提取物和7 μL ddH2O。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 3 min。

1.3 轉(zhuǎn)基因植物材料中目的基因的表達(dá)分析

取生長(zhǎng)14 d的新鮮水稻葉片，迅速加入液氮研磨，使用TRNzol提取試劑盒(天根公司) 提取總RNA。RNA樣品反轉(zhuǎn)錄采用Maxima H Minus First Strand cDNA合成試劑盒(Thermo公司)。半定量PCR引物設(shè)計(jì)(表1) 位于檢測(cè)基因的3?端。PCR反應(yīng)前先將反轉(zhuǎn)產(chǎn)物稀釋5倍，半定量PCR反應(yīng)體系為10×緩沖液2.5 μL，dNTPs 2 μL，正向及反向引物(10 μmol/L) 各1 μL，cDNA稀釋產(chǎn)物5 μL，酶0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。半定量PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，28個(gè)循環(huán)；72 ℃ 3 min。以水稻基因表達(dá)作為內(nèi)參。

表1 引物序列

1.4 水稻幼苗對(duì)PEG和脫水的敏感性分析

選取籽粒飽滿、大小均一的水稻種子。水稻種子經(jīng)75%酒精消毒1 min，用2.5%次氯酸鈉(有效氯含量) 消毒0.5 h后，移至1/2 MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。4 d大的水稻苗轉(zhuǎn)移至含有25%的PEG 6000的1/2 MS固體培養(yǎng)基上繼續(xù)生長(zhǎng)，9 d后移到營(yíng)養(yǎng)液中回復(fù)培養(yǎng)2 d后拍照。脫水處理：將消毒后的種子放入37 ℃培養(yǎng)箱中水培催芽24 h，萌發(fā)后移入營(yíng)養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，取培養(yǎng)14 d的水稻幼苗至吸水濾紙上干旱處理9.5?10 h，重新復(fù)水10 d后拍照。該實(shí)驗(yàn)包含3次生物學(xué)重復(fù)。

1.5 水稻植株干旱處理及分析

消毒后的種子放入37 ℃培養(yǎng)箱中水培催芽24 h，后移入光照培養(yǎng)箱中營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)箱生長(zhǎng)條件為光周期為13 h光照/11 h黑暗，光照時(shí)溫度為28 ℃，黑暗時(shí)溫度為25 ℃。水培一周的小苗移入營(yíng)養(yǎng)土中，營(yíng)養(yǎng)土配比為花卉營(yíng)養(yǎng)土與黃土1∶1，土壤培養(yǎng)溫度及光周期條件不變。待植物長(zhǎng)到四葉期后，干旱處理7 d，復(fù)水10 d后拍照。該實(shí)驗(yàn)包含3次生物學(xué)重復(fù)，所呈現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的代表結(jié)果。

1.6 原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建

水稻原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)載體pJIT163-Ubi由中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育研究所高彩霞研究員提供。Mpsy_3066和Mpsy_0643密碼子優(yōu)化的序列通過(guò)d Ⅲ和GⅠ酶切位點(diǎn)分別克隆到pJIT163-Ubi載體中，新構(gòu)建的載體命名為pJIT163-Mpsy-3066和pJIT163-Mpsy-0643。pJIT163-TrpL-mCherry的TrpL強(qiáng)終止子序列通過(guò)引物(表1) 合成直接插入到d Ⅲ和HⅠ 酶切位點(diǎn)之間，即mCherry表達(dá)框之前，GFP Y67L表達(dá)載體通過(guò)引物(表1) 擴(kuò)增直接引入點(diǎn)突變，新構(gòu)建的質(zhì)粒為pJIT163-GFP Y67L。質(zhì)粒中量提取參考Promega試劑盒Wizard?Midipreps DNA Purification System，調(diào)整質(zhì)粒濃度至1 000 ng/μL。

1.7 水稻原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化及熒光觀察和流式細(xì)胞分析

原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化主要參考Zhang等[21]的方法并進(jìn)行了一定改進(jìn)，水稻MS培養(yǎng)基配制時(shí)添加了肌醇(0.1 g/L)，水稻幼苗在黑暗條件下生長(zhǎng)得到無(wú)菌黃化苗。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化過(guò)程中pJIT163-mCherry、pJIT163-TrpL-mCherry質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化量均為500 ng。用于轉(zhuǎn)化后熒光觀察的原生質(zhì)體移入含2 mL WI溶液的35 mm培養(yǎng)皿中孵育。用于轉(zhuǎn)化后流式細(xì)胞儀檢測(cè)的原生質(zhì)體，置于含200 μL WI溶液的流式管中孵育，轉(zhuǎn)化48 h后進(jìn)行熒光觀察或流式細(xì)胞分析。該實(shí)驗(yàn)包含2次生物學(xué)重復(fù)，所呈現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為該重復(fù)實(shí)驗(yàn)的代表結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 古菌TRAM編碼基因轉(zhuǎn)基因水稻的獲得及表達(dá)分析

我們對(duì)噬冷甲烷古菌R15中兩個(gè)TRAM蛋白的編碼基因和進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法獲得了異源表達(dá)TRAM的轉(zhuǎn)基因水稻。為了驗(yàn)證TRAMs在水稻中是否正常表達(dá)，我們用半定量PCR的方法對(duì)不同轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系中和基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)(圖1)。挑選過(guò)表達(dá)株系進(jìn)行傳代，獲得T2代轉(zhuǎn)基因純合體，對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)繁并用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同轉(zhuǎn)基因水稻株系中TRAM的基因表達(dá)水平

2.2 異源表達(dá)TRAM增強(qiáng)水稻幼苗耐旱能力

為了檢測(cè)異源表達(dá)TRAM是否改變水稻的耐旱能力，我們首先利用PEG模擬干旱處理，檢測(cè)水稻幼苗的生長(zhǎng)情況。我們將4 d大的野生型和各轉(zhuǎn)基因株系水稻幼苗轉(zhuǎn)移至含有25% PEG6000的培養(yǎng)基或正常培養(yǎng)基上繼續(xù)生長(zhǎng)9 d。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在沒(méi)有PEG脅迫處理的情況下，野生型和轉(zhuǎn)基因幼苗生長(zhǎng)沒(méi)有明顯區(qū)別(圖2A、2B)；而在PEG處理后，相比于野生型，轉(zhuǎn)基因幼苗的株高均有不同程度的提高(圖2C、2D)。

圖2 野生型及TRAM轉(zhuǎn)基因水稻幼苗對(duì)PEG處理敏感性的分析

同時(shí)，我們檢測(cè)了短期脫水對(duì)水稻苗期存活率的影響。我們將在培養(yǎng)液中生長(zhǎng)14 d的幼苗置于濾紙上脫水處理9.5 h，復(fù)水10 d后統(tǒng)計(jì)水稻存活率。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因水稻幼苗存活率明顯好于野生型(圖3A、3B)，表明異源表達(dá)TRAM可以顯著提高水稻植株對(duì)失水的耐受性。

圖3 脫水處理后野生型和轉(zhuǎn)基因水稻幼苗的存活率

2.3 異源表達(dá)TRAM增強(qiáng)水稻植株期耐旱能力

為了檢測(cè)水稻植株期耐旱能力，我們將土壤中生長(zhǎng)的四葉期水稻植株干旱處理7 d，然后復(fù)水10 d，比較野生型和轉(zhuǎn)基因植物的耐旱能力。結(jié)果表明，TRAM轉(zhuǎn)基因水稻植株的耐旱能力相比于野生型植株明顯提高(圖4)。

2.4 古菌TRAM蛋白在水稻細(xì)胞中能夠解鏈RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)

為了進(jìn)一步研究古菌TRAM蛋白在植物細(xì)胞中可能的作用機(jī)制，我們以mCherry作為報(bào)告基因構(gòu)建了抗轉(zhuǎn)錄終止報(bào)告系統(tǒng)，即在mCherry熒光蛋白的正常表達(dá)框之前插入了TrpL強(qiáng)終止子序列(圖5A)。這個(gè)序列可以在轉(zhuǎn)錄生成的mRNA上形成雙鏈配對(duì)的結(jié)構(gòu)，影響其后mCherry的翻譯過(guò)程，降低熒光蛋白表達(dá)量。我們將構(gòu)建的該系統(tǒng)在水稻原生質(zhì)體中進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在引入TrpL序列后，mCherry熒光蛋白表達(dá)量明顯下降(圖5B)，證明了這一報(bào)告系統(tǒng)的可靠性。

圖4 TRAM轉(zhuǎn)基因水稻植株耐旱能力增強(qiáng)

圖5 水稻中抗終止報(bào)告系統(tǒng)的建立和驗(yàn)證

基于以上報(bào)告系統(tǒng)，我們對(duì)轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體樣品進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分別統(tǒng)計(jì)其熒光強(qiáng)度，結(jié)果顯示其熒光強(qiáng)度基本呈正態(tài)分布(圖6A)，我們選取轉(zhuǎn)化pJIT163-mCherry和pJIT163- GFP Y67L質(zhì)粒的原生質(zhì)體作為對(duì)照，標(biāo)記其峰面積50%為中間值，以該中間值對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度為基準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)不同轉(zhuǎn)化樣品高于該熒光強(qiáng)度的峰面積各自所占比例(圖6B)，結(jié)合圖6A和6B可以看到共轉(zhuǎn)化或后，其整體熒光強(qiáng)度相比于共轉(zhuǎn)化pJIT163-GFP Y67L質(zhì)粒的熒光強(qiáng)度明顯提高。熒光觀察也進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)果(圖6C、6D、6E)。以上結(jié)果暗示，來(lái)自古菌的TRAM蛋白在水稻中可以打開(kāi)錯(cuò)誤折疊的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，具有RNA分子伴侶的功能。

3 討論

植物可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控響應(yīng)干旱脅迫。一條成熟的mRNA需經(jīng)過(guò)剪接、加帽、多腺苷酸化等一系列過(guò)程才能進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行RNA的翻譯。而在RNA的翻譯過(guò)程中各種RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的錯(cuò)誤折疊也會(huì)影響翻譯的進(jìn)程，使翻譯變得緩慢或直接停滯。為了更好地完成生命活動(dòng)，生物體進(jìn)化出了多種RNA結(jié)合蛋白(RNA binding protein，RBPs)來(lái)完成轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。在干旱脅迫時(shí)，由于機(jī)體的紊亂和受損，RNA分子伴侶的功能的行使顯得更為重要。

TRAM結(jié)構(gòu)域是一類具有RNA結(jié)合活性的多肽片段。在古菌中該結(jié)構(gòu)域單獨(dú)存在，直接作為一個(gè)功能蛋白發(fā)揮著類似于細(xì)菌中Csp蛋白R(shí)NA分子伴侶的功能，這為TRAM蛋白的開(kāi)發(fā)利用提供了更多的方便性和靈活性。根據(jù)已有的報(bào)道，細(xì)菌中Csp蛋白在植物中異源表達(dá)，可以顯著地提高植物耐受干旱的能力。因此，我們推測(cè)古菌中的TRAMs蛋白可能同Csp蛋白一樣在植物中過(guò)表達(dá)可以提高植物耐受干旱的能力。我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了這一猜想。在PEG模擬干旱的處理?xiàng)l件下，我們統(tǒng)計(jì)了植株地上部分的生長(zhǎng)能力。與野生型植物相比，過(guò)表達(dá)TRAM的水稻幼苗植物地上部分生長(zhǎng)能力均有不同程度的提高；在對(duì)苗期植物脫水處理后復(fù)水，水稻幼苗存活率有15%?20%的提高。同時(shí)，我們進(jìn)一步驗(yàn)證了水稻成株期時(shí)耐受干旱脅迫的能力，在干旱處理7 d后，野生型植株在復(fù)水后枯死較多，而異源表達(dá)TRAM的水稻植株仍有半數(shù)以上可以繼續(xù)生長(zhǎng)，證明了轉(zhuǎn)基因組水稻植株在成株期的耐旱能力也有所提升。這些結(jié)果都支持異源表達(dá)TRAM可以提高水稻耐受干旱脅迫的能力。

圖6 古菌TRAM在水稻原生質(zhì)體中對(duì)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的解鏈活性

目前，雖然有大量的文獻(xiàn)報(bào)道了通過(guò)改造植物內(nèi)源基因或表達(dá)異源基因來(lái)提高植物抗旱的能力，但是一些基因在提高水稻抗旱能力的同時(shí)會(huì)影響水稻的生長(zhǎng)。例如，由CaMV 35S啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)的一些轉(zhuǎn)錄因子(如DREB) 會(huì)導(dǎo)致植物生長(zhǎng)緩慢，進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)量下降[22]。AtRZ-1a過(guò)表達(dá)擬南芥植株與野生型相比，表現(xiàn)出種子萌發(fā)遲緩和幼苗生長(zhǎng)變慢的表型。有趣的是，過(guò)表達(dá)古菌TRAM的水稻植株沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的差異，進(jìn)一步支持了該類基因在水稻抗旱性遺傳改良中的利用價(jià)值。

對(duì)于TRAM蛋白在植物細(xì)胞中可能的作用機(jī)制，我們發(fā)現(xiàn)TRAM蛋白在植物細(xì)胞中具有促進(jìn)錯(cuò)誤折疊的RNA結(jié)構(gòu)改變而抗終止的功能，進(jìn)一步證明了古菌TRAMs發(fā)揮RNA分子伴侶的功能。我們推測(cè)TRAM在水稻中也是利用其RNA分子伴侶的功能，在干旱脅迫條件下消除RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的錯(cuò)誤折疊對(duì)蛋白翻譯的影響，從而保證機(jī)體代謝的正常進(jìn)行。

在分子水平上，古菌和真核生物相比有更多的相似之處。古菌在轉(zhuǎn)錄、翻譯及蛋白降解系統(tǒng)的組成元件上，都表現(xiàn)出明顯的真核特征[16]。如，古菌中RNA聚合酶比細(xì)菌中復(fù)雜的多，而且它們的亞基組成與真核生物相似[23]；又如，核糖體的三維結(jié)構(gòu)也預(yù)示真核生物可能與泉古菌門在進(jìn)化上的聯(lián)系[24]。阿斯加德古菌的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步深化了人們對(duì)古菌和真核生物關(guān)系的認(rèn)識(shí)[25-26]。古菌作為生物學(xué)分類中一個(gè)龐大的分支，來(lái)自于古菌更多的分子元件、代謝產(chǎn)物有待我們開(kāi)發(fā)，相信也將在植物基因工程改造上或者在更大范圍獲得更好的利用。

總之，本研究闡明了異源表達(dá)古菌TRAM基因可以提高水稻耐受干旱的能力，TRAM蛋白在植物細(xì)胞中發(fā)揮功能可能是通過(guò)打開(kāi)錯(cuò)誤配對(duì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)以穩(wěn)定RNA的正常代謝。本研究也為開(kāi)發(fā)利用古菌中多樣的分子資源提供了參考。

致 謝 感謝中國(guó)科學(xué)院微生物研究所東秀珠研究員為我們提供TRAM的相關(guān)信息及材料。

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Ectopic expression of archaeal TRAM-encoding genes in rice improves its drought-tolerance

Wei Chen1, 2, Huali Li1, and Jinlong Qiu1

1 Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

Drought stress affects the growth and development of rice, resulting in severe loss in yield and quality. Ectopic expression of the bacterial RNA chaperone, cold shock protein (Csp), can improve rice drought tolerance. Archaeal TRAM (TRM2 and MiaB) proteins have similar structure and biochemical functions as bacterial Csp. Moreover, DNA replication, transcription and translation of archaea are more similar to those in eukaryotes. To test if archaeal RNA chaperones could confer plant drought tolerance, we selected two TRAM proteins, Mpsy_3066 and Mpsy_0643, from a cold-adaptive methanogenic archaeaR15 to study. We overexpressed the TRAM proteins in rice and performed drought treatment at seedling and adult stage. The results showed that overexpression both TRAM proteins could significantly improve the tolerance of rice to drought stress. We further demonstrated in rice protoplasts that the TRAMs could abolish misfolded RNA secondary structure and improve translation efficiency, which might explain how TRAMs improve drought tolerance transgenic rice. Our work supports that ectopic expression of archaeal TRAMs effectively improve drought tolerance in rice.

rice, drought stress, RNA chaperon, archaea, TRAM

March 5, 2019;

March 28, 2019

Jinlong Qiu. Tel/ Fax: +86-10-64807398; E-mail:qiujl@im.ac.cn

2019-04-09

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190408.1036.001.html

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(本文責(zé)編 陳宏宇)