彭勝男，何昊城，苑爽芹，穰杰，胡勝標，孫運軍，余子全，黃偉濤，胡益波，丁學知，夏立秋

基因?qū)毺嵌噫呔∠┗鄽⒕厣锖铣杉吧L發(fā)育的影響

彭勝男，何昊城，苑爽芹，穰杰，胡勝標，孫運軍，余子全，黃偉濤，胡益波，丁學知，夏立秋

省部共建淡水魚類發(fā)育生物學國家重點實驗室 湖南師范大學 生命科學學院 微生物分子生物學湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410081

基因編碼的GDP-巖藻糖合成酶(GDP fucose synthetase，GFS)，能催化由GDP-D-甘露糖合成GDP-L-巖藻糖過程中的兩步差向異構(gòu)酶和還原酶反應；還參與氨基糖和核糖的生物合成，是調(diào)控生物體糖代謝、核苷酸代謝的關(guān)鍵酶之一。通過前期基因組測序表明須糖多孢菌中存在基因。利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了基因的過表達菌株-和敲除菌株-Δ。結(jié)果表明該基因?qū)晟L發(fā)育、蛋白表達及其轉(zhuǎn)錄水平、殺蟲活性、丁烯基多殺菌素的生物合成均存在影響。經(jīng)HPLC分析顯示，-Δ的丁烯基多殺菌素產(chǎn)量增加為野生型菌株的130%，-的丁烯基多殺菌素產(chǎn)量降低了25%。生測結(jié)果顯示，與野生型菌株相比-Δ對棉鈴蟲的殺蟲活性明顯增強，而-的殺蟲活性降低。利用掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，-Δ菌絲體表面出現(xiàn)褶皺，呈現(xiàn)短棒狀，-菌絲形態(tài)與野生型菌株一致。以上結(jié)果表明，基因的敲除影響菌絲體的生長發(fā)育，能促進丁烯基多殺菌素的生物合成和增強殺蟲活性，該基因的過表達抑制了丁烯基多殺菌素的生物合成和降低了殺蟲活性。SDS-PAGE結(jié)果表明，三株菌株在96 h時蛋白表達差異最為明顯。對差異蛋白通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應結(jié)果顯示，三菌株蛋白的轉(zhuǎn)錄水平存在顯著表達差異。通過研究結(jié)果構(gòu)建了網(wǎng)絡(luò)代謝調(diào)控圖，分析基因?qū)毺嵌噫呔L發(fā)育及丁烯基多殺菌素生物合成代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)途徑的影響，初步構(gòu)建了基因調(diào)控的代謝途徑，為揭示丁烯基多殺菌素生物合成的調(diào)控機制及相關(guān)后續(xù)研究提供了實驗依據(jù)。

須糖多孢菌，丁烯基多殺菌素，基因，生物合成，生長發(fā)育

須糖多孢菌屬于放線菌糖多孢菌家族中成員，是一種革蘭氏陽性好氧型菌[1]。丁烯基多殺菌素(Butenyl-spinosyn)是由須糖多孢菌經(jīng)過有氧發(fā)酵后獲得的一類次級代謝產(chǎn)物，其分子結(jié)構(gòu)為類似于多殺菌素的大環(huán)內(nèi)酯類化合物，由丁烯基取代多殺菌素結(jié)構(gòu)上的乙基而成[2-3]。在須糖多孢菌中，丁烯基多殺菌素的合成受到基因簇的嚴格調(diào)控，包括編碼合成糖苷配基、福樂糖胺、鼠李糖和使鼠李糖甲基化的23個基因[4-5]。作為一種綠色、安全、高效的天然殺蟲劑，丁烯基多殺菌素的理化性質(zhì)[6-8]，生物合成途徑[9]、發(fā)酵工藝[10-12]及殺蟲機理[13-15]等均有研究和報道。相比于多殺菌素和其他化學農(nóng)藥而言，丁烯基多殺菌素具有更廣的殺蟲譜和對環(huán)境更為友好等優(yōu)點[16-17]。例如，針對多殺菌素防治效果不佳的蘋果毒蛾和煙青蟲，丁烯基多殺菌素的防治效果則很好，因而被期望用于大范圍的害蟲防治[6,18]。但野生型須糖多孢菌產(chǎn)生丁烯基多殺菌素的含量極低，使其在推廣應用上受到極大的限制[19-20]。因此，通過對須糖多孢菌基因組進行定向遺傳改造[21-23]，促進對丁烯基多殺菌素的生物合成，已成為近年研究的熱點之一。

Becker等的研究表明，細胞質(zhì)中GDP-巖藻糖的生物合成途徑主要分為從頭合成途徑和補救合成途徑[24]。Silvia等研究表明，巖藻糖與細胞間的識別和粘附有關(guān)[25]。Zhou等對人源的GDP-巖澡糖合成酶(FX蛋白) 的研究結(jié)果表明，F(xiàn)X蛋白在結(jié)構(gòu)上由兩個同二聚體組成，且與大腸桿菌的GFS存在一定差別[26]。Somers等的研究表明，GFS在發(fā)揮催化作用時結(jié)合NADPH，并保留Ser-Tyr-Lys催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)[27]。在細菌細胞中，GDP-甘露糖主要參與兩個方面的代謝過程：一是在GDP-甘露糖-4,6-脫水酶和GDP-巖藻糖合成酶的作用下合成GDP-巖藻糖，進入氨基糖和核酸糖的代謝過程二是轉(zhuǎn)化為GDP-D-鼠李糖，進而合成丁烯基多殺菌素[28-29]。GFS在放線菌中也可能發(fā)揮著重要作用，但當下對放線菌中的GFS研究甚少。本文利用遺傳修飾技術(shù)獲得基因的過表達菌株和敲除菌株，研究該基因?qū)毺嵌噫呔纳L發(fā)育和丁烯基多殺菌素的生物合成等方面產(chǎn)生的影響，為促進丁烯基多殺菌素高效生物合成和構(gòu)建高產(chǎn)工程菌株提供了新的技術(shù)途徑。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

本研究中使用的菌株、質(zhì)粒及引物見表1。

表1 菌株、質(zhì)粒及引物

1.2 培養(yǎng)基

大腸桿菌接種于LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜；須糖多孢菌接種于種子活化培養(yǎng)基(CSM) 中，280 r/min、30 ℃培養(yǎng)2 d；接合轉(zhuǎn)移實驗采用R6培養(yǎng)基，工程菌株的發(fā)酵采用半合成發(fā)酵培養(yǎng)基，280 r/min、30 ℃培養(yǎng)10–12 d；產(chǎn)孢能力實驗采用CSM、TSB、BHI和R6培養(yǎng)基。

1.3 fcl基因重組載體的構(gòu)建

1.3.1 過表達載體pOJ260-P-的構(gòu)建及鑒定

過表達載體pOJ260-P-fcl的構(gòu)建流程如圖1A所示。以pOJ260-cm-P為模板，以引物對P-F/P-R進行PCR擴增，得到300 bp左右的P基因片段。以須糖多孢菌為模板，引物對-F-R進行常規(guī)擴增，得到約1.5 kb的基因。然后通過重疊延伸PCR得到1.8 kb左右的P-fcl融合片段(圖1B)。該重組質(zhì)粒經(jīng)過d Ⅲ/RⅠ單雙酶切驗證，結(jié)果表明載體pOJ260-P-fcl構(gòu)建成功(圖1C)。

1.3.2 敲除載體pOJ260-的構(gòu)建及鑒定

敲除載體pOJ260-的構(gòu)建流程如圖2A所示。以須糖多孢菌為模板，引物對-up-F/-up-R，常規(guī)PCR擴增得到約1 kb的基因上游臂片段；引物對-down-F/-down-R，常規(guī)PCR擴增得到約1 kb的基因下游臂片段；引物對Apr-F/Apr-R，常規(guī)PCR擴增得到約1.5 kb的(3) Ⅳ(圖2B)。然后通過重疊延伸PCR得到3.5 kb左右的敲除融合片段。該重組質(zhì)粒經(jīng)過d Ⅲ/RⅠ單雙酶切驗證，結(jié)果表明敲除載體pOJ260-構(gòu)建成功(圖2C)。

1.4 fcl基因工程菌株的構(gòu)建和鑒定

1.4.1基因過表達菌株的構(gòu)建和鑒定

以含目標質(zhì)粒的S17作為供體菌，以須糖多孢菌作為受體菌，進行屬間接合轉(zhuǎn)移，根據(jù)同源重組原理將重組質(zhì)粒整合到須糖多孢菌基因組上。提取和基因組作為模板，以引物對P-F/-R PCR擴增大小為約1.8 kb的P-fcl融合片段；以引物對Apr-F/Apr-R PCR擴增(3)Ⅳ片段。結(jié)果表明，過表達菌株構(gòu)建成功(圖3)。

圖1 過表達載體的構(gòu)建與鑒定

圖2 fcl基因敲除載體的構(gòu)建與鑒定

圖3 fcl基因過表達菌株的構(gòu)建及PCR鑒定

1.4.2基因敲除菌株的構(gòu)建和鑒定

以含重組質(zhì)粒的S17作為供體菌，以須糖多孢菌作為受體菌，進行屬間接合轉(zhuǎn)移試驗，根據(jù)同源重組原理將質(zhì)粒整合至須糖多孢菌基因組上。提取和-Δ基因組作為模板，以引物對-F/-R擴增長度約為1.5 kb的基因，以引物對Apr-F/Apr-R PCR擴增(3)Ⅳ基因片段。結(jié)果表明，成功獲得敲除菌株-Δ(圖4)。

圖4 fcl基因敲除菌株的構(gòu)建及PCR驗證

1.5 fcl基因?qū)晟L發(fā)育及菌絲體形態(tài)特征的影響

生長曲線測定：以半合成發(fā)酵培養(yǎng)基為空白對照，每12 h測定培養(yǎng)基中600值，按稀釋倍數(shù)計算各瓶培養(yǎng)基中的實際600值。實驗重復 3次，繪制生長曲線。

產(chǎn)孢能力和菌絲體形態(tài)的觀察：取100 μL野生型菌株和工程菌株、- Δ菌液分別涂布于BHI、CSM、TSB以及R6培養(yǎng)基固體平板中間區(qū)域。每24 h觀察不同平板上孢子的產(chǎn)生情況并記錄。同時各取1 mL培養(yǎng)96 h的發(fā)酵液，超純水滅菌后清洗菌體沉淀15次以上，在液氮中固定，低溫、真空條件下鍍金，利用日立SU8010冷場掃描電子顯微鏡觀察。此外，對菌體沉淀加入戊二醛溶液進行固定，用不同濃度的乙醇溶液進行梯度脫水，低溫下鍍金，利用日立SU8010超高分辨率掃描電子顯微鏡進行菌絲體形態(tài)觀察。

1.6 fcl基因?qū)臧l(fā)酵液殺蟲活性的影響

各取1 mL三株菌發(fā)酵10 d的發(fā)酵液，分別與20 mL棉鈴蟲飼料進行混勻后倒入24孔板中，待凝固后，每個孔內(nèi)放置1條生長狀態(tài)相同的棉鈴蟲，置于26–28 ℃恒溫培養(yǎng)6 d，期間每24 h觀察并記錄棉鈴蟲存活數(shù)。

1.7 fcl基因?qū)甓∠┗鄽⒕厣锖铣僧a(chǎn)量的影響

超聲破碎細胞法對第10天的發(fā)酵液(等體積乙酸乙酯萃取) 進行破碎，經(jīng)真空冷凍濃縮完全凍干等處理后，加入50 μL甲醇溶解沉淀。利用Agilent 1290超高效液相色譜儀(UHPLC) 檢測丁烯基多殺菌素含量，檢測條件如文獻[3]所述，并收集目的峰進行質(zhì)譜鑒定。

1.8 fcl基因?qū)毺嵌噫呔w蛋白的影響

參照文獻[10]進行菌株第2、4、6、8、10天蛋白的提取，經(jīng)SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)第4天蛋白差異最大。

1.9 轉(zhuǎn)錄水平的qRT-PCR測定

利用Trizol試劑提取菌株、、-Δ的RNA。分別以野生型菌株及工程菌株第4天的反轉(zhuǎn)錄cDNA作為模板，16S RNA作為內(nèi)參，利用7500實時熒光定量PCR系統(tǒng)儀器(Applied Biosystems，USA)，對基因、、進行轉(zhuǎn)錄水平驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 fcl基因?qū)毺嵌噫呔L發(fā)育的影響

為確定基因?qū)毺嵌噫呔L的影響，利用分光光度計每12 h對發(fā)酵液600進行測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，直至72 h時，過表達菌株的生長變化與野生型菌株基本一致；野生型菌株從96 h開始進入穩(wěn)定期，過表達菌株從84 h開始進入穩(wěn)定期；相較于野生型菌株而言，-的600值略有降低，但與生長趨勢基本一致；兩株菌株均于156 h進入衰退期，216 h衰退穩(wěn)定。敲除菌株-Δ生長緩慢，108 h進入穩(wěn)定期，132 h進入衰退期，228 h衰退穩(wěn)定，600值明顯下降。說明基因的敲除抑制了須糖多孢菌的生長，使細胞密度下降；該基因過表達后，菌株細胞密度與野生型菌株基本一致(圖5)。

2.2 fcl基因?qū)毺嵌噫呔w形態(tài)和產(chǎn)孢能力的影響

為研究基因?qū)w形態(tài)的影響，利用超高分辨率掃描電鏡和冷場掃描電鏡對發(fā)酵96 h的野生型菌株、過表達菌株與敲除菌株-Δ的菌絲體形態(tài)進行觀察。結(jié)果表明，與野生型菌株菌絲體表面光滑無褶皺，分支較多；-Δ菌絲表面褶皺明顯，菌絲體呈現(xiàn)短棒狀；說明的過表達對菌體生長無明顯影響，敲除后對菌絲體的生長發(fā)育具有抑制作用(圖6、7)。

為研究對須糖多孢菌在不同固體培養(yǎng)基上產(chǎn)孢能力的影響，分別觀察野生型菌株和工程菌株在4種培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 3株菌株均從第48 h開始產(chǎn)生孢子；120 h時，和野生型菌株在CSM和TSB培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢能力最強；-Δ在R6培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢能力最弱，三菌株在BHI培養(yǎng)基上產(chǎn)孢能力相同。三株菌株自身在4種培養(yǎng)基上產(chǎn)孢能力也存在差異，由強到弱依次為CSM、TSB、BHI、R6。可能是由于培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的不同，從而導致須糖多孢菌同一菌株在上述4種培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢能力出現(xiàn)明顯差異(圖8)。

圖5 fcl基因工程菌株的生長曲線

圖6 fcl基因工程菌株超高分辨場掃描電子顯微鏡觀察

圖7 fcl基因工程菌株冷場掃描電子顯微鏡觀察

2.3 fcl基因?qū)Χ∠┗鄽⒕禺a(chǎn)量影響的 比較

為確定基因?qū)Χ∠┗鄽⒕厣锖铣傻挠绊懀肏PLC分析野生型菌株、過表達菌株以及敲除菌株- Δ發(fā)酵液中丁烯基多殺菌素的產(chǎn)量。利用質(zhì)譜對13 min的色譜峰進行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該時間點的色譜峰含有分子量為189.1的三甲基鼠李糖碎片峰(圖9)，證明該物質(zhì)是丁烯基多殺菌素組分[30]。HPLC結(jié)果顯示，在保留時間為13 min處的丁烯基多殺菌素峰面積為606.2 mAU。在該時間段的峰面積為455.4 mAU，丁烯基多殺菌素的產(chǎn)量降低為野生型菌株的75%。-Δ在該段時間內(nèi)的峰面積為786 mAU，丁烯基多殺菌素的產(chǎn)量提高至野生型菌株的130% (圖10)。表明基因的敲除能促使丁烯基多殺菌素產(chǎn)量的提高，過表達使產(chǎn)量降低。

2.4 fcl基因?qū)臧l(fā)酵液殺蟲活性的影響

為研究基因工程菌株發(fā)酵液對棉鈴蟲殺蟲活性的影響，利用三菌株第10天的發(fā)酵液對棉鈴蟲進行生物殺蟲活性測定。結(jié)果顯示，與野生型菌株相比，-的殺蟲活性最弱，半致死時間較野生型菌株推遲約0.7 d。-Δ發(fā)酵液的殺蟲活性明顯增強，半數(shù)致死時間較野生型菌株提前約0.6 d (表2)。以上結(jié)果表明，基因的敲除有利于菌株殺蟲活性的增強，過表達后殺蟲活性減弱(圖11)。

圖8 fcl基因工程菌株在固體培養(yǎng)基上產(chǎn)孢能力比較

圖9 fcl基因工程菌株丁烯基多殺菌素的質(zhì)譜鑒定

圖10 fcl基因工程菌株丁烯基多殺菌素產(chǎn)量的比較分析

2.5 fcl基因工程菌株蛋白SDS-PAGE分析及差異蛋白鑒定

為研究基因?qū)毺嵌噫呔鞍妆磉_的 影響，利用SDS-PAGE分析野生型菌株.、敲除菌株-Δ和過表達菌株蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第4天的菌株蛋白差異最大。第4天時，中蛋白條帶A、B和C表達量降低；-Δ中蛋白條帶A和C表達量明顯升高，蛋白條帶B表達量降低(圖12)。將差異蛋白條帶膠內(nèi)酶解后進行質(zhì)譜鑒定，發(fā)現(xiàn)它們分別為35 kDa的ECF亞家族RNA聚合酶σ-24亞基(RopE)、57 kDa的分子伴侶(GroEL) 以及144 kDa的DNA指導的RNA聚合酶亞基β(RopB)。利用在線蛋白分析軟件Uniprot和KEGG等對其進行功能分析(表3)。

表2 fcl基因工程菌株對棉鈴蟲殺蟲活性的測定

圖11 fcl基因工程菌株對棉鈴蟲殺蟲變化柱狀圖

2.6 轉(zhuǎn)錄水平的qRT-PCR測定

為了對差異蛋白的表達量進行驗證，利用熒光定量PCR(qRT-PCR)對其轉(zhuǎn)錄水平進行測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第4天時，敲除菌株-Δ中和轉(zhuǎn)錄水平相對于野生型菌株分別上調(diào)5.422、2.189倍；的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)為野生型菌株的1.828倍。過表達菌株-中，、及的轉(zhuǎn)錄水平相對于野生型菌株分別下調(diào)4.329、1.529、2.336倍(圖13)，證實了這些基因在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平變化趨勢一致。

圖12 fcl基因工程菌株蛋白的SDS-PAGE分析

表3 fcl基因工程菌株差異蛋白的質(zhì)譜鑒定

圖13 fcl基因工程菌株中基因轉(zhuǎn)錄水平的qRT-PCR檢測

3 結(jié)論

基因編碼的GDP-巖藻糖合成酶在氨基糖和核酸糖的代謝中起著至關(guān)重要的作用，是影響鏈霉菌生長發(fā)育的重要調(diào)控基因。丁烯基多殺菌素的推廣應用受到野生型菌株產(chǎn)量低的限制，如何提高丁烯基多殺菌素的產(chǎn)量是當前亟待解決的問題。通過對須糖多孢菌基因進行基因工程改造后獲得基因的過表達菌株-和敲除菌株-Δ。

已有關(guān)于基因及其編碼GDP-巖藻糖合成酶的研究表明，細胞的基因具有重要調(diào)控作用。Mabeau等通過從海帶和褐藻小葉海膽等多種生物體的細胞壁中分離出巖藻糖后發(fā)現(xiàn)，巖藻糖有助于增強細胞壁的穩(wěn)定性[31]。Beatriz等在盤基網(wǎng)柄菌中的研究結(jié)果表明，當HL250菌株不能將GDP-甘露糖轉(zhuǎn)化為GDP-巖藻糖時，作為孢子外殼的一組蛋白質(zhì)的糖基化受阻，使得孢子外殼的完整性被破壞，導致孢子的產(chǎn)生和萌發(fā)受到抑制[32]。此外，還有研究報道巖藻糖具有促進細胞抗病毒和抗氧化等功能[33-34]。本研究發(fā)現(xiàn)基因的敲除對須糖多孢菌的生長發(fā)育和產(chǎn)孢能力都有一定的抑制作用。與同一培養(yǎng)時間點的野生型菌株相比，-Δ的細胞密度減小，菌株在R6培養(yǎng)基上產(chǎn)孢能力最弱；但對基因進行過表達后，-的細胞密度無明顯變化，在CSM和TSB培養(yǎng)基上產(chǎn)孢能力與野生型菌株相同，均表現(xiàn)為最強。Black等的研究表明，巖藻糖有助于防止細胞發(fā)生脫水[35]。本研究中，S.-菌絲體形態(tài)與野生型菌株一致，-Δ的菌絲體變短，表面出現(xiàn)皺縮。結(jié)合相關(guān)研究報道及本文研究結(jié)果表明，基因?qū)毺嵌噫呔纳L發(fā)育具有關(guān)鍵調(diào)控作用。

Michela等的研究表明，在草履蟲小球藻病毒中，GDP-甘露糖能夠在GDP-甘露糖-4,6-脫水酶和GDP-4-酮基-6-脫氧-D-甘露糖差向異構(gòu)酶/還原酶的催化作用下被轉(zhuǎn)化為GDP-鼠李糖[36]。多殺菌素的生物前體是dTDP-鼠李糖，包括d (A、T、C、G) DP-鼠李糖4種。通過KEGG代謝通路分析可知，GDP可以轉(zhuǎn)化為dGDP，因而GDP-鼠李糖也是參與丁烯基多殺菌素合成代謝的重要物質(zhì)，能夠促進丁烯基多殺菌素的生物合成。利用LC-MS對3個差異蛋白RNA聚合酶亞基β、ECF亞家族RNA聚合酶σ-24亞單位以及分子伴侶進行鑒定，運用KEGG、Uniprot和NCBI等軟件對差異蛋白進行了功能分析。分析結(jié)果顯示，基因編碼DNA指導的RNA聚合酶亞基β和編碼ECF亞家族RNA聚合酶σ-24亞單位在RNA的生物合成中發(fā)揮重要的作用，RNA作為模板大量翻譯出與丁烯基多殺菌素生物合成的酶及其他相關(guān)蛋白。基因編碼分子伴侶可以通過影響氮代謝途徑中核糖體蛋白因子，進而影響蛋白質(zhì)的翻譯和組裝，并且參與RNA的降解過程。實驗結(jié)果表明，與野生型菌株相比，-Δ丁烯基多殺菌素的產(chǎn)量增加為野生型菌株的130%；-丁烯基多殺菌素的產(chǎn)量下降到野生型菌株的75%。-Δ中、以及基因的轉(zhuǎn)錄水平表現(xiàn)為上調(diào)，雖然EL基因的轉(zhuǎn)錄水平也出現(xiàn)一定的下調(diào)，但由于其下調(diào)倍數(shù)較小，對于細胞中RNA的整體含量而言沒有較大影響，因而丁烯基多殺菌素的產(chǎn)量因前體物質(zhì)和相關(guān)酶類含量的增多而得到增加，對棉鈴蟲的殺蟲活性相應顯著提高。-中和以及基因的轉(zhuǎn)錄水平均表現(xiàn)為下調(diào)，丁烯基多殺菌素的產(chǎn)量因前體物質(zhì)和相關(guān)酶類含量的減少而降低，對棉鈴蟲的殺蟲活性相應降低。

綜上所述，基因可以通過影響丁烯基多殺菌素的前體物質(zhì)和RNA的合成過程、細胞脫水以及細胞壁的穩(wěn)定性等方面，影響到菌絲體的生長發(fā)育、形態(tài)變化以及丁烯基多殺菌素的生物合成。通過對須糖多孢菌中GDP-巖藻糖合成酶編碼基因進行敲除和過表達，觀察野生型菌株與工程菌株在表型和丁烯基多殺菌素生物合成之間存在的差異。結(jié)果表明基因不僅在須糖多孢菌生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用，而且與次級代謝產(chǎn)物丁烯基多殺菌素的生物合成密切相關(guān)，依據(jù)上述基礎(chǔ)構(gòu)建出了基因參與的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖(圖14)，為后續(xù)如何進一步促進須糖多孢菌丁烯基多殺菌素的生物合成和提高產(chǎn)量提供了重要基礎(chǔ)。

圖14 須糖多孢菌中fcl基因的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

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Effect ofgene for butenyl-spinosyn biosynthesis and growth of

Shengnan Peng, Haocheng He, Shuangqin Yuan, Jie Rang, Shengbiao Hu, Yunjun Sun, Ziquan Yu, Weitao Huang, Yibo Hu, Xuezhi Ding, and Liqiu Xia

State Key Laboratory Breeding Base of Microbial Molecular Biology, College of Life Sciences, Hunan Normal University, State Key Laboratory of Development Biology of Freshwater Fishes, Changsha 410081, Hunan, China

Thegene encodes GDP-fucose synthase, which catalyzes two-step differential isomerase and reductase reactions in the synthesis of GDP-L-fucose from GDP-D-mannose. It also participates in the biosynthesis of amino sugar and ribose sugar, and is one of the key enzymes to regulate the metabolism of sugar and nucleotides in organisms. The presence ofgene inwas found through sequencing result of genome. The mutant-and-Δwere constructed by gene engineering technology. The results showed that the gene had an effects on growth and development, protein expression and transcriptional level, insecticidal activity, and biosynthesis of butenyl-spinosyn of. The results of HPLC analysis showed that the yield of butenyl-spinosyn inΔwas 130% compared with that in, which reduced by 25% in-. The results of determination of insecticidal activity showed that-Δhad a stronger insecticidal activity againstthan that of, while the-had a lower insecticidal activity againstcompared with. Scanning electron microscopy (SEM) was used to observe the morphology of the mycelia. It was found that the surface of the-Δwas wrinkled, and the mycelium showed a short rod shape. There was no significant difference in mycelial morphology between-and. Aboved all showed that deletion ofgene inhindered the growth and development of mycelia, but was beneficial to increase the biosynthesis of butenyl-spinosyn and improve insecticidal activity. Whereas thegene over-expression was not conducive to the biosynthesis of butenyl-spinosyn and reduced their insecticidal activity. SDS-PAGE results showed that the difference of protein expression among the three strains was most obvious at 96 hours, which was identified by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, the results showed that there were significant differences of related genes in transcriptional levels among the three strains. Based on the results of the study, a network metabolic control map was constructed to analyze the effect ofgene on growth and the regulation pathway of butenyl-spinosyn biosynthesis, which provided an experimental basis for revealing the regulation mechanism of butenyl-spinosyn biosynthesis and related follow-up studies.

, butenyl-spinosyn,gene, biosynthesis, growth and development

April 17, 2019;

June 3, 2019

Major Program of Hunan Province (No. 2017NK1030), National Basic Research Program of China (863 Program) (No. 2011AA10A203), National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2012CB722301), National Natural Science Foundation of China (No. 31770106), Hunan Province Biological Development Engineering and New Product Development Collaborative Innovation Center (No. 20134486), Hunan Education Department Project (No. 10CY013).

s: Shengbiao Hu. Tel: +86-731-88872905; E-mail: shengbiaohu@hunnu.edu.cn

Liqiu Xia. Tel: +86-731-88872298; E-mail: xialq@hunnu.edu.cn

彭勝男, 何昊城, 苑爽芹, 等.基因?qū)毺嵌噫呔∠┗鄽⒕厣锖铣杉吧L發(fā)育的影響. 生物工程學報, 2019, 35(9): 1662–1675.

Peng SN, He HC, Yuan SQ, et al. Effect ofgene for butenyl-spinosyn biosynthesis and growth of. Chin J Biotech, 2019, 35(9): 1662–1675.

湖南省重大項目 (No. 2017NK1030)，國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃 (863計劃) (No. 2011AA10A203)，國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃 (973計劃) (No. 2012CB722301)，國家自然科學基金 (No. 31770106)，湖南省生物發(fā)育工程及新產(chǎn)品研發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心項目 (No. 20134486)，湖南省教育廳項目 (No. 10CY013) 資助。

(本文責編 郝麗芳)