章樂生 王旗 李清越 張世清 楊榮笙 呼明闖 黃建國(guó) 汪天平*

肺吸蟲病是由并殖吸蟲感染引起的一種重要的人獸共患食源性寄生蟲病[1]，流行于亞洲、非洲和美洲等25個(gè)國(guó)家或地區(qū)。目前全球已報(bào)道的并殖吸蟲有50余種[2]，在我國(guó)寄生于人體的并殖吸蟲主要有衛(wèi)氏并殖吸蟲和斯氏并殖吸蟲[3]。其中衛(wèi)氏并殖吸蟲發(fā)現(xiàn)較早，分布廣泛，是人體最主要的致病蟲種。依據(jù)衛(wèi)氏并殖吸蟲囊蚴在體內(nèi)是否發(fā)育成為成蟲并產(chǎn)卵，可將宿主動(dòng)物分為適宜和非適宜宿主[4]。本實(shí)驗(yàn)擬用衛(wèi)氏并殖吸蟲囊蚴感染適宜宿主犬和非適宜宿主大鼠，并以衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲抗原為探針，檢測(cè)適宜和非適宜宿主感染后的抗體，觀察抗體水平動(dòng)態(tài)變化情況。

材料與方法

一、衛(wèi)氏并殖吸蟲囊蚴獲取

從肺吸蟲病歷史流行區(qū)安徽休寧縣藍(lán)田鎮(zhèn)采集溪蟹，將溪蟹搗碎后其碎渣倒入20目、40目、60目的三層網(wǎng)篩中，并用清水沖洗過篩；40目網(wǎng)篩及60目網(wǎng)篩中的細(xì)渣用清水沖入錐形量杯中，自然沉淀3～5 min，待上層水基本澄清后，輕輕棄去上層肉屑；錐形量杯中再次加入適量的清水，同樣自然沉淀，重復(fù)3～5次；錐形量杯中最后一次沉淀物倒入培養(yǎng)皿中，解剖鏡下觀察并挑取囊蚴，并在顯微鏡下進(jìn)行鑒定。

二、動(dòng)物感染與血清收集

家犬(市購)4只，體重約10 kg，實(shí)驗(yàn)前經(jīng)改良加藤法對(duì)糞便進(jìn)行病原學(xué)檢查，均未發(fā)現(xiàn)寄生蟲蟲卵，經(jīng)口灌服阿苯達(dá)唑預(yù)防性驅(qū)蟲治療(劑量：每只犬0.2 g/d，連續(xù)2 d)后，每只犬感染囊蚴100只，于犬下肢靜脈收集1～3號(hào)犬感染前和感染后1～16周的血清，4號(hào)犬感染84 d后解剖取成蟲。

SD大鼠6只(購自合肥史文斯試驗(yàn)用品銷售部)，隨機(jī)分配為感染組和對(duì)照組(每組各3只)；感染組每只大鼠口飼法感染囊蚴20只，對(duì)照組不予感染；于感染前和感染后1～16周收集大鼠尾末梢血清。

三、成蟲收集及抗原提取

4號(hào)犬囊蚴感染84 d后，解剖，從肺中分離出肺吸蟲成蟲，用0.9%生理鹽水洗凈后挑取蟲體。加入0.01%硫柳汞生理鹽水，并用組織研磨器進(jìn)行研磨處理。凍融3 d，每天2次，低溫離心10 000 g 30 min后取上清，即為成蟲可溶性抗原，BCA測(cè)定蛋白含量為9 μg/μl。

四、ELISA體系建立及抗體檢測(cè)

將衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲可溶性抗原用pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋為10 μg/ml，包被96孔酶標(biāo)板，每孔加抗原液100 μl，4℃過夜；PBST洗滌2次后用5%脫脂奶粉于37℃水浴箱封閉1 h，每孔加封閉液300 μl；再用PBST洗滌2次，加入經(jīng)pH 7.2 PBS稀釋后的待測(cè)血清，每孔100 μl，犬、鼠血清分別按1∶100、1∶3200稀釋，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照(加稀釋液100 μl)，陰性對(duì)照(100 μl未感染的犬、鼠血清)；加樣后酶標(biāo)板置于37℃水浴箱孵育30 min，再用PBST洗滌3次后，每孔加入100 μl稀釋后的酶標(biāo)二抗，其中二抗分別為羊抗狗IgG(Abcom公司，貨號(hào)：ab112840)和兔抗鼠IgG(上海生工，貨號(hào)：D110098-0100)，犬、鼠二抗分別按1∶50 000、1∶1 000稀釋；37℃水浴箱孵育30 min后，PBST洗滌3次，加入100 μl TMB室溫避光顯色15 min，最后加入50 μl 2mol/L H2SO4終止反應(yīng)，雙波長(zhǎng)測(cè)定OD值(檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm，參考波長(zhǎng)630 nm)。判斷標(biāo)準(zhǔn)：樣本OD值/陰性對(duì)照OD值(S/N)≥2.1時(shí)，判定為陽性(犬0周血清為陰性對(duì)照，鼠的陰性對(duì)照為同時(shí)期3只對(duì)照鼠血清OD值的平均值)。

結(jié) 果

一、衛(wèi)氏并殖吸蟲囊蚴和成蟲觀察

現(xiàn)場(chǎng)采集的溪蟹經(jīng)搗碎過濾和沉淀后，于解剖鏡下觀察并挑取囊蚴。囊蚴在解剖鏡下呈乳白色球形，囊壁較厚，直徑約300～400 μm，內(nèi)含后尾蚴，顯微鏡下可見蟲體黑色的排泄囊和2個(gè)彎曲的腸支。

感染84 d犬解剖后，見心臟及肺臟周圍粘膜上偶見小孔，肺臟上有明顯囊腫。解剖剪剪開囊腫囊后，可見每個(gè)囊內(nèi)有1～2條肺吸蟲成蟲，見圖1。成蟲體型橢圓，肉紅色，口腹吸盤大小略等；壓片鏡檢見卵巢位于腹吸盤兩側(cè)，5～6葉，睪丸4～6葉，卵巢較睪丸長(zhǎng)而大[5]。其他3只犬于飼養(yǎng)16周后不同時(shí)期解剖，在肺臟中均發(fā)現(xiàn)并提取出成蟲。

圖1 衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲

二、抗體變化情況

1.犬抗體反應(yīng)

3只感染犬經(jīng)ELISA檢測(cè)，均出現(xiàn)抗體陽性反應(yīng)。1號(hào)犬第6周抗體陽性(OD值為1.124，S/N=2.24)，第12周抗體水平達(dá)到高峰(OD值為1.827，S/N=3.64)，其后維持在S/N=3.08～3.51；2號(hào)犬第3周抗體陽性(OD值為1.847，S/N=2.57)，第5周抗體水平達(dá)到高峰(OD值為1.952，S/N=2.72)，其后維持在S/N=2.37～2.71；3號(hào)犬第3周抗體陽性(OD值為1.314，S/N=2.15)，第15周抗體水平呈現(xiàn)高峰(OD值為1.641，S/N=2.68)，見圖2。

圖2 ELISA法檢測(cè)感染衛(wèi)生并殖吸蟲犬血清抗體動(dòng)態(tài)變化

2.鼠抗體反應(yīng)

3只感染鼠1周檢測(cè)抗體陽性(1-3號(hào)大鼠血清抗體檢測(cè)OD值分別為0.932、1.947和1.049，S/N范圍為5.39～11.26)，2～3周抗體水平即達(dá)到高峰；其后抗體逐漸下降，感染后8～16周仍呈陽性，抗體水平維持較低水平，見圖3。

圖3 ELISA法檢測(cè)感染衛(wèi)氏并殖吸蟲大鼠血清

討 論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，感染犬于第3周左右檢測(cè)抗體陽性，并在第5～12周抗體水平達(dá)到高峰，截至感染后的第16周，抗體仍維持在較高水平，此研究結(jié)果與章子豪、陳韶紅等[6,7]研究結(jié)果一致，與衛(wèi)氏并殖吸蟲囊蚴進(jìn)入犬體至發(fā)育為成蟲的生理時(shí)間(60～90 d)相吻合。感染大鼠后1周檢測(cè)抗體陽性，2～3周抗體水平達(dá)到高峰，后抗體水平有所下降，至第8周抗體經(jīng)ELISA檢測(cè)維持在較低的陽性水平。大鼠感染肺吸蟲囊蚴2～3周，童蟲抗體被成蟲可溶性抗原探針檢測(cè)到，說明童蟲和成蟲存在共同抗原，與Yoon Kong等[8]試驗(yàn)結(jié)果一致；后期抗體水平下降并最終維持在一定水平，推測(cè)與童蟲在機(jī)體移行過程中發(fā)生了免疫逃避[9]有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)顯示，以衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲可溶性抗原做探針，可檢測(cè)適宜和非適宜宿主體內(nèi)抗體水平變化情況，為肺吸蟲病的免疫學(xué)診斷提供理論依據(jù)。在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)大鼠經(jīng)囊蚴感染后1周即檢測(cè)出衛(wèi)氏并殖吸蟲抗體，早于犬2周，可能與囊蚴感染數(shù)量、物種差異等有關(guān)所致，但還需要開展進(jìn)一步研究。

安徽皖南山區(qū)為衛(wèi)氏并殖吸蟲的自然疫源地[10,11]，何毅勛等[12]通過對(duì)皖南兩種衛(wèi)氏并殖吸蟲品系特征的比較，認(rèn)為我國(guó)衛(wèi)氏并殖吸蟲存在大小兩種品系。小型品系對(duì)人體寄生不適應(yīng)，未能發(fā)育成熟而停留在童蟲階段，因此人是小型品系的非適宜宿主；且通過本試驗(yàn)研究表明，人作為非適宜宿主對(duì)于衛(wèi)氏并殖吸蟲的感染存在通過抗體檢測(cè)達(dá)到診斷的可能。

章子豪等[6]曾以衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲抗原做探針，采用IHA法檢測(cè)感染大鼠的血清，結(jié)果顯示成蟲抗體陽性反應(yīng)較弱，且出現(xiàn)時(shí)間較遲，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有所差別，這可能是ELISA檢測(cè)較IHA法更敏感有關(guān)。盡管抗體檢測(cè)可以作為衛(wèi)氏并殖吸蟲感染的免疫學(xué)診斷方法，但也存在早期診斷和療效考核等方面的不足，且成蟲粗抗原與其他寄生蟲存在共同抗原，因此應(yīng)著手開始敏感性高、特異性強(qiáng)的診斷分子的篩選[13](如cDNA文庫建立及診斷分子的篩選等)以及分子生物學(xué)診斷方法的建立[14](如LAMP等)。

此外，本實(shí)驗(yàn)還對(duì)收集自休寧的溪蟹囊蚴大小進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)了較大的衛(wèi)氏并殖吸蟲囊蚴，最大尺寸大小約541 μm×564 μm，可能為三倍體型囊蚴[15,16]。大型品系肺吸蟲囊蚴一旦被人體誤食，極易引起咳嗽、咯血、咯痰及浸潤(rùn)性、囊腫和結(jié)節(jié)等較重的臨床癥狀，故應(yīng)引起科研人員以及臨床醫(yī)務(wù)人員的高度重視。