高奎鵬 孫培明

一株雞毒支原體的致病性研究與藥敏試驗

高奎鵬 孫培明*

（臨沂大學農林科學學院 山東 臨沂 276000）

為了對1株從雞場分離到雞毒支原體進行致病性的研究以及敏感藥物的篩選。試驗對20枚孵化5日齡的SPF雞胚進行了兩種不同濃度毒株的攻毒試驗，觀察雞胚的死亡及剖檢情況，并將死亡雞胚卵黃壁上的支原體回收，進行9種常用藥物的敏感性試驗。結果表明：接種不同濃度均出現(xiàn)死胚，高濃度組雞胚死亡率高達100%，而低濃度組的雞胚死亡率為70%，剖檢氣囊有纖維素滲出，氣管、支氣管栓塞現(xiàn)象；藥敏試驗表明：兩種毒株已對恩諾沙星和大觀霉素等藥物敏感性降低，而對泰妙菌素和妙達安兩種藥物敏感性較高。說明毒株的致病力較強，對子代造成了孵化率降低、弱雛并伴呼吸道病變的影響，但敏感藥物對其具有明顯的抑制作用。

雞毒支原體 致病性 雞胚卵黃囊接種 剖檢 藥敏試驗

雞毒支原體(MG)感染又稱雞敗血支原體感染，由于其病程長，是雞呼吸道病的一種，又稱之為慢性呼吸道病(CRD)，在雞主要表現(xiàn)為慢性呼吸道癥狀、氣囊炎等。其特征是咳嗽、流鼻液，呼吸時有啰音。本病是危害肉仔雞生產的主要疾病[1]。隨著養(yǎng)雞規(guī)模加大、飼養(yǎng)方式改變和飼養(yǎng)密度提高，該病發(fā)病率越來越高，主要影響雛雞生長、使成年雞產蛋減少，造成養(yǎng)雞業(yè)經(jīng)濟上的重大損失，危害性日益突出[2-3]，本文對已分離到的兩種毒株進行了致病性的研究及對支原體藥物敏感性的試驗，證實了毒株濃度對致病性的影響，并為臨床防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗毒株 LJ，由山東省濟南市某種雞場病雞體內，通過Fery培養(yǎng)液分離培養(yǎng)得到，經(jīng)分子生物學鑒定為雞毒支原體。

1.1.2 試驗雞胚 SPF雞胚，由濟南濟南賽斯家禽科技有限公司提供。SPF雞胚與全自動孵化箱用0.1%新潔爾滅消毒后，放入20枚胚體大小相等的健康雞胚，孵化5d備用。

1.1.3 試驗藥品 取養(yǎng)殖場常用于治療雞毒支原體的藥物替米考星(批號K0311805，含量89%)、泰妙菌素(批號110803008，含量99%)、妙達安(主要成分80%延胡索酸泰妙菌素，批號163085181，含量45%)、林可霉素(批號9912001，含量85%)、氟苯尼考(批號160252108，含量97%)、強力霉素(批號170407，含量98%)、恩諾沙星(批號100571296，含量99%)、左氧氟沙星(批號220832126，含量98%)和大觀霉素(批號010272602，含量779u/mg)9種藥物，均購自青島華盛獸藥股份有限公司

1.1.4 儀器 恒溫培養(yǎng)箱(型號101-3B，上海景邁儀器設備有限公司)；全自動孵化機(型號FHJ001，上海景邁儀器設備有限公司)

1.2 方法

1.2.1 支原體攻毒試驗 本次試驗為研究支原體的致病性，將試驗按菌液濃度不同分為兩大組A組和B組(表1)。A組10枚雞胚，分為2組，每組5枚雞胚，1組為試驗組，卵黃囊接種[4]支原體菌液0.3ml，2組為對照組。B組10枚雞胚，分為2組，每組5枚雞胚，I組為試驗組，卵黃囊接種用Fery培養(yǎng)液1:1000稀釋的菌液，每枚0.3ml，II組為對照組。

表1 雞胚分組情況

1.2.2 孵化 為防止相互干擾，將A組與B組接種后的雞胚分別放在兩個全自動孵化機內進行孵化，每日照蛋、觀察死亡情況。

1.2.3 雞毒支原體的回收 將孵化過程中死亡的雞胚取卵黃壁，卵黃，氣囊，氣管、支氣管分泌物浸泡于Fery液體培養(yǎng)液中，用無菌的組織剪剪碎卵黃壁、氣囊、氣管和支氣管，浸泡20min后，用0.45μm的細菌濾器過濾于無菌的西林瓶中，放入恒溫培養(yǎng)箱，待培養(yǎng)液變黃后，以雞毒支原體與Fery液體培養(yǎng)液1:9的劑量傳代至穩(wěn)定備用[5-6]。

1.2.4 藥品的處理 參照美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)的標準進行藥品濃度稀釋，稀釋后用0.22微米細菌濾器分別過濾藥液備用。替米考星(含量89%)原粉0.2876g溶于200ml水中，-20℃保存?zhèn)溆茫瑑群?280μg/ml。泰妙菌素(含量99%)原粉0.2586g溶于200ml水中，-20℃保存?zhèn)溆?，內?280μg/ml。妙達安(含量45%)原粉0.5689g溶于200ml水中，-20℃保存?zhèn)溆?，內?280μg/ml。林可霉素(含量85%)原粉0.3012g溶于200ml水中，-20℃保存?zhèn)溆?，內?280μg/ml。氟苯尼考(含量97%)原粉0.2639g溶于200ml水中，-20℃保存?zhèn)溆?，內?280μg/ml。強力霉素(含量98%)原粉0.2612g溶于200ml水中，-20℃保存?zhèn)溆?，內?280μg/ml。恩諾沙星(含量99%)原粉0.2585g溶于200ml水中，-20℃保存?zhèn)溆?，內?280μg/ml。左氧氟沙星(含量98%)原粉0.2612g溶于200ml水中，-20℃保存?zhèn)溆?，內?280μg/ml。大觀霉素(含量779u/mg)原粉0.3286g溶于200ml水中，-20℃保存?zhèn)溆?，內?280μg/ml。

1.2.5 最低抑菌濃度測定 （1）顏色變化單位(CCU)的測定：取15支試管，每個試管先加入1ml Fery培養(yǎng)液，再向每組第1管內加入0.2ml菌液，按10倍倍比稀釋至第14孔，第15孔做空白對照；重復3次，蓋上試管塞，防治污染，37℃培養(yǎng)，每日觀察結果，記錄試管顏色變化，當變色試管不再增加后確定終點。將導致顏色改變的菌液最高稀釋度看做為1CCU/ml[7]。（2）最低抑菌濃度(MIC)測定：將試驗以藥品名稱分為9組，每組14支試管，無菌操作每個試管先加入1ml Fery培養(yǎng)液，再取0.4ml配置好的藥液加入第一支試管，充分混勻后取出0.4ml至第二管，以此類推，等比稀釋至第13管，第13管吸出0.4ml棄去，第14管為對照；再向每組1~13管中各加入回收后生長穩(wěn)定的雞毒支原體菌液5000CCU/ml。將試管放入培養(yǎng)箱，每日觀察結果，記錄試管顏色變化，當變色試管不再增加后確定終點。以抑制雞毒支原體生長的抗生素的最高稀釋度作為最低抑菌濃度[7]。

3 結果與分析

3.1 攻毒試驗雞胚的死亡情況

雞胚攻毒試驗后每天對雞胚進行照蛋檢查，并記錄雞胚的死亡情況見表2。

表2 雞胚死亡總數(shù)

由表2可見：LJ組接種原液的雞胚在接種7d后開始死亡，16d后(第21天)，死亡率100%；而接種1:1000倍稀釋過的菌液雞胚10d后開始死亡，16d后(第21天)，死亡率70%。

3.2 雞胚的孵出和生長情況

（1）A組孵化21d后，試驗組無雞胚孵化成功；對照組孵出10只。（2）B組孵化21d后，試驗澤孵出3只；對照組10只。

3.3 雞胚的剖檢情況

A組與B組雞胚的在剖檢過程中，未孵出雞胚出現(xiàn)氣管、支氣管內有白色栓塞物，孵出弱雛死后剖檢發(fā)現(xiàn)接種支原體的雞胚其支氣管和氣囊均有纖維素滲出，根據(jù)H.W.Yoder將氣嚢病理損傷判斷，A組較為明顯，均為3級；B組均為2級；對照組致死剖檢均為0級。氣嚢病理損傷計分結果參考：H.W.Yoder將氣嚢病理損傷分為5級：（1）O級：氣嚢正常，薄而透明；（2）1級：氣嚢僅有稍增厚的灰色區(qū)或黃色滲出斑點；（3）2級：部分氣嚢易見到灰至黃色滲出，有時出現(xiàn)泡沫，氣嚢增厚；（4）3級；大部分氣嚢增厚，布滿大量黃白色干酪物；（5）4級：幾乎整個氣嚢布滿黃白色干酪樣滲出物，氣嚢嚴重增厚[8-9]。

3.4 顏色變化單位(CCU)的測定結果

試管放入恒溫培養(yǎng)箱7d后，變色試管不再增加，終點稀釋濃度LJ為10-7，顏色變化單位為107CCU/ml。

3.5 最低抑菌濃度測定結果

試管放入恒溫培養(yǎng)箱10d后，以抑制雞毒支原體生長的抗生素的最高稀釋度作為最低抑菌濃度，結果見表3。

表3 各種藥物對毒株的顏色變化單位 (CCU/ml)

由于Fery培養(yǎng)液配制時因為加入了酚紅而表現(xiàn)粉紅色，若有支原體生長，則支原體利用培養(yǎng)液中的營養(yǎng)而產生一些酸性產物，液體的顏色則會由粉紅色變成黃色，以此來判斷培養(yǎng)液中是否有支原體生長。由表3可見：對于雞毒支原體LJ來說，泰妙菌素與妙達安兩種藥物的MIC為最大，敏感性較高，而對恩諾沙星，大觀霉素等藥物敏感性降低。

4 討論

（1）支原體疾病嚴重影響著雞胚的孵化率，降低雛雞的生長速度，使成年雞產蛋率下降等不良影響，雞支原體病發(fā)病慢，病程長，可與其他病原混合感染或繼發(fā)感染，如大腸桿菌、新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性鼻炎等混合感染，很難根除，給養(yǎng)殖戶帶來很大經(jīng)濟損失[10]。（2）本試驗采用養(yǎng)殖場分離到的支原體毒株LJ，經(jīng)過SPF雞胚的卵黃囊接種試驗，根據(jù)雞胚接種支原體的菌液濃度的不同，發(fā)現(xiàn)兩組均出現(xiàn)死胚，高濃度組雞胚死亡率高達100%，而低濃度組的雞胚死亡率為70%，剖檢發(fā)現(xiàn)氣囊有纖維素滲出，氣管、支氣管栓塞現(xiàn)象，以接種雞胚分別與對照組的雞胚死亡情況和剖檢情況可以做出分析，LJ致病力較強，對雞胚的孵化率有很大影響，卵黃囊內的支原體可直接造成雛雞的呼吸系統(tǒng)病變，尤其是在出殼前的1~2d，而且濃度越高，雞胚死亡速率越高，病變越明顯。（3）長期以來，防制雞毒支原體感染時，人們常常使用不同的抗生素，其中應用最為廣泛的藥物是泰樂菌素、紅霉素、喹諾酮類和氨基糖苷類等抗菌素，但由于疫苗的使用、抗生素的濫用等情況，防治效果已不確定。本試驗結果顯示，該株支原體對替米考星，林可霉素，恩諾沙星，左氧氟沙星，大觀霉素敏感度已降低，對泰妙菌素，妙達安表現(xiàn)敏感較高，可做臨床用藥的借鑒依據(jù)。盡管體外藥敏試驗結果顯示對部分藥物敏感，但臨床使用時不僅需要疫苗防疫和藥物治療，更需要包括加強飼養(yǎng)管理和生物安全等綜合措施。

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（2019–06–05）

山東省現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系家禽創(chuàng)新團隊項目(SDAIT-11-17)

S852.62

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1007-1733(2019)09-0004-03