楊修鎮(zhèn) 陳玲 尹伶靈 張呈軍 牛華星 懂玲玲 吉利偉

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛肉中泰拉霉素代謝物殘留量研究

楊修鎮(zhèn) 陳玲 尹伶靈 張呈軍 牛華星 懂玲玲 吉利偉

（山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所 山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東 濟(jì)南 250022） （山東舍里樂藥業(yè)有限公司 山東濟(jì)寧）

建立牛肉中泰拉霉素代謝物的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，色譜柱為C18(100mm× 2.1mm，1.7μm)，以0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，采用電噴霧離子源正離子檢測(cè)模式(ESI+)和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式測(cè)定，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。結(jié)果表明，泰拉霉素代謝物進(jìn)樣濃度在1~100ng/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系(r2=0.9999)；方法檢出限和定量限分別為10μg/kg和30μg/kg；定量限、1/2MRL、MRL和2MRL 4個(gè)添加水平下，回收率在70%~110%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。本方法簡便、準(zhǔn)確、快速、靈敏，適用于牛肉中泰拉霉素代謝物殘留量的檢測(cè)。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 牛肉 泰拉霉素代謝物

泰拉霉素是一種動(dòng)物專用的新型半合成的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，與其他許多大環(huán)內(nèi)酯類抗生素不同的是，其具有3個(gè)堿性氨基基團(tuán)，酸解離常數(shù)(pKa)分別為8.6、9.6、9.9，這些特征有利于穿通革蘭氏陰性菌的外膜[1]。研究表明[2, 3]，與泰樂菌素、替米考星、恩諾沙星和氟苯尼考等藥物相比，泰拉霉素具有抗菌活性強(qiáng)、藥物代謝動(dòng)力學(xué)特征卓越、臨床療效好、減緩細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生等優(yōu)點(diǎn)，在畜牧業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。我國農(nóng)業(yè)部在2008年第957號(hào)公告中首次批準(zhǔn)進(jìn)口泰拉霉素原料藥和泰拉霉素注射液在國內(nèi)使用[4]。EMA[5]和FDA[6]以泰拉霉素代謝物CP-60300為代謝標(biāo)示物，并通過每日允許最大攝入量和放射標(biāo)記法殘留消除試驗(yàn)規(guī)定了代謝標(biāo)示物最大殘留限量。基于此本文對(duì)牛肉中泰拉霉素代謝標(biāo)示物的殘留檢測(cè)方法進(jìn)行了研究。

圖1 泰拉霉素代謝物化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜儀(Waters Xevo TQ-S)：配有電噴霧離子源(ESI)；電子天平(感量0.01g、0.00001g)；高速分散均質(zhì)機(jī)(FJ-200)；多管渦旋振蕩器(VX-III)；離心機(jī)(CF16RXⅡ，轉(zhuǎn)速10000 r/min)；氮吹儀(N-EVAP-112)；有機(jī)濾膜(0.22 μm)；固相萃取儀裝置及MCX固相萃取柱(Waters公司)；泰拉霉素代謝物標(biāo)準(zhǔn)品(山東魯抗舍里樂藥業(yè)有限公司高新區(qū)分公司自制，含量94.7%)；甲醇、甲酸為色譜純；鹽酸為優(yōu)級(jí)純；水為超純水；其余試劑均為分析純。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密稱取泰拉霉素代謝物標(biāo)準(zhǔn)品10mg，置10ml容量瓶中，用50%甲醇水溶液(含0.1%甲酸)溶解并稀釋至刻度，配制成濃度各為1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。精密量取泰拉霉素代謝物貯備液100μl，置10ml容量瓶中，用甲醇-0.1%甲酸溶液(1:9，v/v)稀釋至刻度，配制成濃度為10μg/ml的溶液，再精密量取100μl，置10ml容量瓶中，用甲醇-0.1%甲酸溶液(1:9，v/v)稀釋至刻度，配制成濃度為1μg/ml的溶液。

1.3 前處理?xiàng)l件

1.3.1 提取 根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]方法，稱取勻漿后的樣品1g(精確至0.01g)置50ml離心管中，加入2mol/L鹽酸4.5ml，渦旋1min，振蕩提取10min，置60℃水浴消化1h，10000r/min離心10min，收集上清液，下層加入2mol/L鹽酸4.5ml，重復(fù)提取一次，合并上清液，加水定容至10ml，精密量取1ml加水4ml渦旋混勻，備用。

1.3.2 凈化 MCX固相萃取柱依次用3ml甲醇和3ml水活化，取備用液全部過柱，再依次用0.1mol/L HCl、甲醇各3ml洗滌，抽干，用5%氨化甲醇5ml洗脫。洗脫液于50℃水浴氮?dú)獯蹈?，殘余物中加甲?0.1%甲酸溶液(1:9，v/v)1ml渦旋1min復(fù)容，10000r/min離心5min，過0.22μm濾膜，濾液供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱：BEH C18(100mm×2.1 mm，1.7μm)；流動(dòng)相：A相為0.1%甲酸甲醇溶液，B相為0.1%甲酸水溶液；流速：0.3ml/min；進(jìn)樣量：5μl。柱溫：35℃；洗脫條件如表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

1.4.2 質(zhì)譜條件 電離模式：電噴霧正離子(ESI+)，毛細(xì)管電壓：3.2kv，離子源溫度：150℃，脫溶劑溫度：450℃，脫溶劑氣流速：550L/Hr，錐孔反吹氣流速：50L/Hr；脫溶劑氣、錐孔氣、碰撞氣均為高純氮，采集方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，泰拉霉素代謝物的定性、定量離子見表2。

表2 泰拉霉素代謝物特征離子參考質(zhì)譜條件

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的專屬性

選擇20個(gè)牛肉空白樣品按照1.3項(xiàng)方法處理后，在規(guī)定的測(cè)試條件下進(jìn)行檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)有假陽性結(jié)果，表明該方法的專屬性良好。

2.2 基質(zhì)效應(yīng)

稱取牛肉空白樣品1g(精確至0.01g)，平行六份，按照1.3項(xiàng)方法處理至“洗脫液于50℃水浴氮?dú)獯蹈伞?。精密吸取濃度?μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液100μl，置10ml容量瓶中，用甲醇-0.1%甲酸溶液(1:9，v/v)稀釋至刻度，配制成濃度為10ng/ml的溶液，分別精密吸取1ml置空白樣品吹干的基質(zhì)中，渦旋1min復(fù)容，10000r/min離心5min，過0.22μm濾膜，在規(guī)定的測(cè)試條件下進(jìn)行檢測(cè)，所得面積均值和RSD如表3所示。結(jié)果表明，牛肉基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液與溶劑標(biāo)準(zhǔn)品溶液相比有明顯的基質(zhì)抑制作用，因此，后續(xù)試驗(yàn)均采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量校正。

圖2 牛肉空白樣品

圖3 牛肉空白樣品添加30μg/kg

表3 基質(zhì)效應(yīng) (ng·ml-1、%)

2.3 線性范圍

精密吸取1μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作液，用甲醇-0.1%甲酸溶液(1:9，v/v)配制濃度為1、2、4、10、40、100ng/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密吸取1ml分置空白樣品吹干的基質(zhì)中，渦旋1min復(fù)容，10000 r/min離心5min，過0.22μm濾膜，在規(guī)定的測(cè)試條件下進(jìn)行檢測(cè)，以泰拉霉素代謝物定量離子峰面積為縱坐標(biāo)，泰拉霉素代謝物濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：y=3415.6x-578.65，曲線的R2為0.9999，在1~100ng/ml濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4 方法的靈敏度

在牛肉空白樣品中添加泰拉霉素代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液，1.3項(xiàng)方法處理后，在規(guī)定的測(cè)試條件下進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算信噪比。滿足歐盟657號(hào)決議[8]規(guī)定的定性條件的最低添加量為本方法的檢出限，大于檢出限，定量離子色譜峰的信噪比(S/N)滿足在10：1以上且回收率滿足70%~110%之間的最低添加量為本方法的定量限[9]。本方法的檢出限為10μg/kg，定量限為30 μg/kg。

2.5 方法的準(zhǔn)確度和精密度

取3批牛肉空白樣品，每批中添加泰拉霉素代謝物30μg/kg(LQD)、150μg/kg(1/2MRL)、300 μg/kg(MRL)、600μg/kg(2MRL)4個(gè)不同濃度，每個(gè)濃度平行5份，1.3項(xiàng)方法處理后，在規(guī)定的測(cè)試條件下進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算回收率，回收率在70%~ 110%之間，批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，結(jié)果見表4。

表4 方法準(zhǔn)確度與精密度 (μg·㎏-1、%)

2.6 100批樣品檢測(cè)結(jié)果

從農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)隨機(jī)購買的100批牛肉按照本研究建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均有3批檢出泰拉霉素代謝物，其中1批低于定量限，另外兩批分別為36.4μg/kg、48.2μg/kg，遠(yuǎn)低于最大殘留限量。

3 討論與小結(jié)

（1）前處理過程中提取時(shí)嘗試了多種提取液，包括乙腈、甲醇、水、鹽酸溶液，測(cè)試結(jié)果表明，泰拉霉素代謝物極性較大且具有堿性，在鹽酸溶液中的提取率最高，依據(jù)參考文獻(xiàn)[7]選用2 mol/L鹽酸消化處理后干擾物明顯減少。MCX固相萃取柱具有反相和陽離子交換雙重保留性能，對(duì)堿性化合物具有良好的保留能力，凈化后基線更為平直，回收率大大提高。（2）泰拉霉素作為一種新藥，其在畜禽產(chǎn)品中的殘留研究報(bào)道較少，劉勇軍等[10]建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)測(cè)定豬肉樣品中泰拉霉素殘留的方法，徐曹燕等[11]建立了雞組織中泰拉霉素殘留的檢測(cè)方法，檢測(cè)的都是泰拉霉素原型，而目前沒有關(guān)于泰拉霉素原型的最大殘留限量規(guī)定。國內(nèi)通過檢測(cè)泰拉霉素代謝標(biāo)志物來檢測(cè)組織中泰拉霉素殘留的研究較少，本方法用2 mol/L鹽酸消化提取，MCX固相萃取柱凈化，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜正離子模式測(cè)定，結(jié)果泰拉霉素代謝物在牛肉中的檢測(cè)限為10μg/kg、定量限為30μg/ kg，遠(yuǎn)低于最大殘留限量，滿足殘留檢測(cè)要求。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程簡單、快速，回收率較高，精密度好，適用于牛肉中泰拉霉素代謝物殘留量的檢測(cè)。

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（2019–05–20）

S818.9

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1007-1733(2019)09-0001-04