張潔 郭紹貴 任毅 張海英 宮國(guó)義 周明 王貴章 宗梅 何洪巨 劉凡 許勇

目的與意義：果實(shí)瓤色變化是西瓜果實(shí)成熟的重要標(biāo)志。西瓜果肉細(xì)胞中的有色體不斷發(fā)育并積累各種類胡蘿卜素物質(zhì)導(dǎo)致了西瓜果實(shí)瓤色的出現(xiàn)。前人的研究著重于分析在類胡蘿卜素合成途徑中各種重要酶類的變化對(duì)瓤色的影響，而對(duì)于作為類胡蘿卜素代謝途徑載體的有色體的發(fā)育過程的解析不足。我們著重分析了不同瓤色西瓜中有色體的發(fā)育過程的異同，并發(fā)現(xiàn)了保障其正常運(yùn)轉(zhuǎn)的重要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。其中一類磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（PHT）在模式作物擬南芥的研究中表明，其對(duì)維持葉綠體、淀粉體等質(zhì)體的代謝反應(yīng)起到舉足輕重的作用，但PHT在有色體中的作用與功能尚無報(bào)道。基于西瓜不同發(fā)育時(shí)期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，我們?cè)谖鞴现惺状伟l(fā)現(xiàn)一個(gè)在果實(shí)中特異表達(dá)的基因PHT類基因，該基因在紅瓤和白瓤西瓜中的表達(dá)量和轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)序列存在顯著差異，因此，我們極為關(guān)注該基因的功能及其蛋白表達(dá)及轉(zhuǎn)錄調(diào)控是否最終影響有色體的發(fā)育，從而影響西瓜瓤色形成。

材料與方法：選取西瓜試驗(yàn)材料為東亞類型的紅瓤栽培品種‘97103（Citrullus lanatus subsp. vulgaris East-Asia Ecotype）和近緣白瓤野生種‘PI296341-FR（Citrullus lanatus subsp. lanatus）。通過透射電鏡觀察西瓜果肉細(xì)胞的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中有色體的發(fā)育及成熟過程。通過密度梯度離心法提取西瓜果實(shí)完整有色體。提取不同果實(shí)不同發(fā)育階段的RNA，進(jìn)行果實(shí)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（美國(guó)康奈爾大學(xué)費(fèi)章軍教授合作完成）。通過互補(bǔ)酵母磷轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷株驗(yàn)證其磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能。制作了該蛋白的特異抗體，通過免疫膠體金亞細(xì)胞定位結(jié)合果肉細(xì)胞原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化等方法確定候選蛋白的表達(dá)部位。通過對(duì)該基因序列及表達(dá)水平的差異分析，發(fā)現(xiàn)特異的順式調(diào)控元件，利用酵母單雜交體系進(jìn)行候選轉(zhuǎn)錄因子的篩庫(kù)試驗(yàn)。結(jié)合EMSA試驗(yàn)及煙草葉片瞬時(shí)轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，檢測(cè)候選轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合能力。同時(shí)還試驗(yàn)了糖分、ABA、乙烯及其抑制劑處理對(duì)西瓜瓤色發(fā)育的影響。

結(jié)果與分析：首先分析了紅瓤材料‘97103與白瓤材料‘PI296341-FR在果瓤細(xì)胞發(fā)育中的差異。通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在紅瓤材料中細(xì)胞中有更多的前質(zhì)體發(fā)育為有色體，且在有色體中大量積累了類胡蘿卜素類物質(zhì)。而白瓤果實(shí)中的有色體發(fā)育少，且其中只積累了為數(shù)不多的類胡蘿卜素色球。此外研究還發(fā)現(xiàn)，紅瓤西瓜果瓤細(xì)胞中的有色體質(zhì)膜在有色體發(fā)育過程中變化明顯。在深入了解西瓜有色體發(fā)育的基礎(chǔ)上，通過反向遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了一個(gè)在果實(shí)中特異表達(dá)的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ClPHT4;2（基因編號(hào)：Cla017962），其表達(dá)情況與紅瓤西瓜有色體發(fā)育過程一致，且通過酵母磷轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷株驗(yàn)證了其磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能。進(jìn)一步通過免疫膠體金及熒光共定位分析發(fā)現(xiàn)，ClPHT4;2蛋白確實(shí)定位在有色體質(zhì)膜上。這些結(jié)果揭示了該蛋白在有色體發(fā)育中具有重要功能。通過果實(shí)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果及熒光定量PCR試驗(yàn)證實(shí)ClPHT4;2基因是果實(shí)特異表達(dá)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，且該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)錄水平在2個(gè)品種的果瓤變化上差異顯著。隨著‘97103果實(shí)的發(fā)育，該基因表達(dá)水平顯著提高，與授粉后10 d的果實(shí)相比，授粉后26 d果實(shí)中基因表達(dá)量提高了近250倍。而在‘PI296341-FR的果實(shí)發(fā)育中該基因一直維持在較低的表達(dá)水平?；虮磉_(dá)水平依賴于基因啟動(dòng)子上游調(diào)控區(qū)的序列特征，比較2個(gè)品種該基因5上游1 500 bp調(diào)控區(qū)的堿基序列可以發(fā)現(xiàn)有20處單堿基變化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該基因啟動(dòng)子區(qū)的順式調(diào)控元件在2個(gè)品種間存在顯著不同，由于SNP的變化使得‘97103基因啟動(dòng)子序列中多出了2個(gè)ABRE及一個(gè)ERE結(jié)構(gòu)域。這2種調(diào)控元件的產(chǎn)生意味著在‘97103中該基因可能受到更多信號(hào)的調(diào)控，我們認(rèn)為順式調(diào)控元件的出現(xiàn)可以部分揭示‘97103品種中該基因表達(dá)水平迅速提高的原因。通過篩選控制ClPHT4;2基因在不同瓤色西瓜品種中差異轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子，得到了可以結(jié)合該ABRE結(jié)構(gòu)域的2個(gè)候選bZIP類轉(zhuǎn)錄因子。此外還研究了糖分、ABA及乙烯途徑對(duì)果實(shí)瓤色發(fā)育的調(diào)控作用。

結(jié)? ? 論： 清晰系統(tǒng)地闡明了西瓜白瓤野生種進(jìn)化到栽培種西瓜中有色體發(fā)育過程的異同;并且首次揭示了栽培西瓜后期大量有色體破裂形成番茄紅素小囊，是西瓜比番茄中的番茄紅素更容易吸收的一個(gè)重要原因;此外還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)定位于有色體質(zhì)膜中的磷轉(zhuǎn)蛋白基因的高量表達(dá)，是栽培西瓜瓤色形成的必要條件。針對(duì)該新發(fā)現(xiàn)的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的進(jìn)一步研究表明，該基因可以被成熟相關(guān)因子如ABA、乙烯以及糖濃度所調(diào)控。該項(xiàng)研究為一步揭示激素及糖分信號(hào)調(diào)控果肉細(xì)胞有色體發(fā)育提供了重要的節(jié)點(diǎn)基因證據(jù)，為全面闡明果實(shí)有色體發(fā)育機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。