胡仲遠 陳淑娜 吳維芳 張明方

目的與意義： miRNA在調(diào)控植物生物與非生物抗性中具有重要作用，而嫁接是提高西瓜對逆境抗性的重要技術措施。在嫁接誘導的西瓜營養(yǎng)脅迫響應能力改變過程中的功能有待研究揭示?；虮磉_分析是探究在miRNA介導的分子調(diào)控機制的一種重要的手段，選取合適的內(nèi)參基因來排除誤差是取得可靠的表達結果的前提。由于分子結構和表達特征的相似性，miRNA或者其它小分子RNA比較適合作為miRNA表達分析的內(nèi)參。因此，本研究旨在篩選出在正常養(yǎng)分條件和氮，磷營養(yǎng)脅迫下，以及在嫁接西瓜接穗和砧木（南瓜，葫蘆）中進行miRNA定量分析的內(nèi)參基因，為研究miRNAs在嫁接西瓜中調(diào)控養(yǎng)分脅迫響應中的功能奠定基礎。

材料與方法： 以西瓜‘早佳為接穗，以葫蘆‘甬砧1號和南瓜‘非常輔佐為砧木。西瓜嫁接、自嫁和實生苗培養(yǎng)在 Hoagland營養(yǎng)液（7.5 mmol·L-1 氮和0.3 mmol·L-1 磷， pH=6）中，煉苗5 d后，分別進行低磷（0.01 mmol·L-1）和低氮 （0.75 mmol·L-1）處理。脅迫5 d后取相應的葉片和根系樣品用于miRNA表達分析。本研究共選取了17個候選內(nèi)參基因，包括：選自嫁接西瓜苗的小RNA測序中發(fā)現(xiàn)的嫁接前后穩(wěn)定表達的7個miRNAs （miR81，miR82，miRl66b，miRl70，miR3511-3p，miR319b，miR398b 和 miRl66u），其他物種中已經(jīng)報道的內(nèi)參miRNA的葫蘆科同源miRNAs（miRl69n-5p，miRl67， miRl67c，miRl67b 和 miRl60a）和2個編碼蛋白質(zhì)的內(nèi)參基因YLS8和PP2A以及常用的非編碼RNA（U6和18S）。數(shù)據(jù)分析主要通過：1）使用軟件StepOne v2.3計算每條引物的擴增效率（E）和相關系數(shù)（R2）。2）使用軟件geNorm和NormFinder分析每個內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。3）使用從嫁接西瓜的小RNA數(shù)據(jù)庫中挑選出一個響應營養(yǎng)協(xié)迫的miR85 驗證待選內(nèi)參的可靠性。

結果與分析： （1）miRNA表達分析中的一些miRNAs（miR167c，miR167f和miR166b）的穩(wěn)定性通常都高于蛋白質(zhì)編碼基因（YLS8和PP2A），說明它們更適合嫁接和養(yǎng)分脅迫下做矯正miRNA表達分析的內(nèi)參。（2）沒有單一內(nèi)參可以在不同物種和不同養(yǎng)分情況下都保持穩(wěn)定性。miR167c或miR166b是在正常養(yǎng)分條件下接穗和砧木中最穩(wěn)定的內(nèi)參。miR167c和miR167f是在低氮或低磷脅迫下的西瓜和南瓜樣品中最穩(wěn)定的內(nèi)參，而miR166b是營養(yǎng)脅迫下的葫蘆樣品中最穩(wěn)定的內(nèi)參。（3）miR85的矯正結果表明使用最優(yōu)的內(nèi)參基因和最優(yōu)的內(nèi)參組合矯正得到的定量結果與使用最差的內(nèi)參得到的結果差異顯著。通過將不同內(nèi)參矯正結果與高通量測序數(shù)據(jù)比對，發(fā)現(xiàn)miR166b和miR167c可分別作為正常養(yǎng)分條件下的嫁接西瓜接穗和砧木中合適的內(nèi)參基因。（4）在嫁接西瓜中的多物種共生特性使用單個內(nèi)參通常會使定量結果發(fā)生一定程度的變化，建議使用最優(yōu)內(nèi)參組合矯正表達分析結果。

結? ? 論： miRNA更適合作為嫁接和養(yǎng)分脅迫下做矯正miRNA表達分析的內(nèi)參。miR167c，miR167f和miR166b適合作為嫁接西瓜及養(yǎng)分脅迫下做矯正miRNA表達分析的內(nèi)參基因。