王祖哲，馬普，王軍琦，左愛華，彭聰，詹龍全，孫天利，包衛(wèi)洋

（1.大連深藍(lán)肽科技研發(fā)有限公司，遼寧大連116000；2.常熟理工學(xué)院，江蘇常熟215500；3.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連116023）

海參有主補(bǔ)元?dú)?、滋養(yǎng)五臟六腑和袪虛損的養(yǎng)生功能[1-2]。其中刺參（Apostichopus japonicus）是國內(nèi)公認(rèn)的營養(yǎng)價值最高的海參品種，且以產(chǎn)自遼寧的遼刺參最佳[3-4]。刺參中蛋白質(zhì)含量豐富，是其主要功效成分[5-6]，所含氨基酸種類齊全，富含甘氨酸、羥脯氨酸、羥賴氨酸及精氨酸等堿性氨基酸[7-8]。但是海參蛋白分子量大，高達(dá)300 kDa，難以直接吸收利用，因此人們利用生物酶解技術(shù)把海參蛋白酶解成小分子的海參肽，海參肽具有溶解性、穩(wěn)定性好、黏度低，易于消化吸收、生物效價高、無抗原性等優(yōu)點(diǎn)，研究表明海參肽具有降血壓、降血糖、抗氧化、提高免疫力、保護(hù)人體表皮細(xì)胞，防止黑色素沉淀、抗衰老等諸多功能[9-13]，具有廣闊的開發(fā)及應(yīng)用前景。

肽的質(zhì)量是決定其功效的重要因素，由于所選海參原料、蛋白酶制劑、酶解條件及生產(chǎn)工藝的不同，海參肽的氨基酸組成、分子量大小及分布、低聚肽含量、營養(yǎng)成分、功效等均有所差別，目前國家尚未有統(tǒng)一的海參肽標(biāo)準(zhǔn)，市面上的一些海參肽產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，魚龍混雜，甚至出現(xiàn)一些假冒偽劣產(chǎn)品，造成了市場的混亂并危害人民的健康，因此有必要對海參肽的品質(zhì)進(jìn)行全面評價，為建立海參肽統(tǒng)一規(guī)范的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

雖然關(guān)于海參肽的抗疲勞作用已有報道，如盧連華、王洪濤、付學(xué)軍等[14-16]研究了海參肽對小鼠的抗疲勞作用，但是這些研究所采用的海參肽或是企業(yè)提供，無任何產(chǎn)品相關(guān)信息，或來自實驗室小規(guī)模制備，僅顯示分子量大小?？傊煤㈦牡钠焚|(zhì)及質(zhì)量均不明確，對僅有2～10 個氨基酸組成的刺參低聚肽的抗疲勞功效更沒有明確報道。

本文在前期大量酶解工藝及生產(chǎn)工藝優(yōu)化的基礎(chǔ)上，以遼刺參為原料制備刺參低聚肽，并對刺參低聚肽的氨基酸組成、分子量分布、營養(yǎng)成分、微量元素、獸藥及農(nóng)藥殘留、食用安全性等進(jìn)行質(zhì)量評價，在此基礎(chǔ)上依據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》[17]選取負(fù)重游泳試驗、血清尿素、肝糖原3 項生化指標(biāo)，對刺參低聚肽的抗疲勞功效進(jìn)行研究，并與目前市面上常用產(chǎn)品大豆低聚肽、海參粉的抗疲勞效果進(jìn)行比較，為刺參低聚肽的廣泛應(yīng)用及抗疲勞保健品的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品

海參粉、遼刺參：大連鑫玉龍海洋生物種業(yè)科技股份有限公司；刺參低聚肽、大豆低聚肽：大連深藍(lán)肽科技研發(fā)有限公司。

1.2 實驗動物與主要試劑

健康的昆明種小鼠 300 只，體重（20±2）g，全部為雄性，購于大連醫(yī)科大學(xué)，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（遼）2013-0003，使用許可證號為SYXK（遼）2013-0006。血清尿素氮（BUN）試劑盒、肝糖原試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器設(shè)備

YS-08 型粉碎機(jī)：北京燕山正德機(jī)械設(shè)備有限公司；XS204SX 型電子秤：瑞士梅特勒儀器有限公司；UV752 型分光光度計：上海佑科儀器儀表有限公司；DK-S26 型恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；IECCL31R 型離心機(jī)：美國Thermo Scientific 公司；TG16-WS 高速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀儀器有限公司；MDS-6（ECH-11）型微波消解儀：上海新儀微波化學(xué)科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 刺參低聚肽的制備

遼刺參經(jīng)脫鹽、斬碎、磨漿處理后加入復(fù)合蛋白酶酶解，酶解后經(jīng)過離心、膜分離、除重金屬、脫色、脫腥、脫鹽與噴霧干燥等工藝分離制得刺參低聚肽粉。

1.4.2 質(zhì)量指標(biāo)檢測

刺參低聚肽中蛋白含量采用GB/T 5009.5-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》中凱氏定氮法進(jìn)行測定；灰分含量的測定依據(jù)GB/T 5009.4-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分的測定》進(jìn)行測定；水分含量依據(jù)GB/T 5009.3-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測定》進(jìn)行測定。微量元素由譜尼測試進(jìn)行檢測，獸藥殘留農(nóng)藥殘留由SGS 檢測，急性經(jīng)口毒性試驗由寧波出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心進(jìn)行測試。

1.4.3 氨基酸組成及分子量分布測定

刺參低聚肽送江南大學(xué)分析測試中心，氨基酸組成采用GB/T5009.124-2003《食品中氨基酸的測定》方法測定，分子量分布按GB/T22729-2008《海洋魚低聚肽粉》中高效凝膠過濾色譜法進(jìn)行測定。

1.4.4 試驗分組及灌胃劑量選擇

將小鼠隨機(jī)分為10 組，每組30 只，分別為陰性對照組；刺參低聚肽低、中、高劑量組；大豆低聚肽低、中、高劑量組；海參粉低、中、高劑量組，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后灌胃。參考王洪濤等[11]對海參肽抗疲勞試驗的給藥劑量，設(shè)定低、中、高劑量組的灌胃劑量依次為0.085、0.17、0.50 g/kg。陰性對照組給予同體積的蒸餾水。各組小鼠每日灌胃1 次，每周稱一次體重，連續(xù)灌胃30 d后，測定各項指標(biāo)。

1.4.5 小鼠體重的測定

小鼠在灌胃前、灌胃1 周、灌胃2 周、灌胃3 周、灌胃4 周后分別稱重，并做記錄。

1.4.6 負(fù)重游泳實驗

末次灌胃30 min 后，在小鼠尾部負(fù)7%體重的鉛皮，放入水溫（25±1）℃的游泳箱（100 cm × 100 cm ×80 cm）內(nèi)，水深不低于30 cm，用秒表記錄小鼠自游泳開始至溺亡的時間。

1.4.7 血清尿素氮的測定

末次灌胃30 min 后，將其置于溫度為（30±1）℃的游泳箱中不負(fù)重游泳90 min，休息60 min 后采用拔眼球采全血約0.5 mL（不加抗凝劑）。放置4 ℃冰箱約3 h，待血凝固后于2 000 r/min 離心15 min，取血清按血尿素氮測定試劑盒說明書將各試劑加入到各個試管中。加完后混勻，置沸水中準(zhǔn)確水浴15 min，立即用自來水冷卻。在波長520 nm 處用紫外分光光度計測得吸光度值，計算出血清尿素氮的含量。

1.4.8 肝糖原的測定

末次灌胃30 min 后，采用斷頸法將小鼠處死，取肝臟經(jīng)生理鹽水漂洗后用濾紙吸干，按樣本重量（mg）∶堿液體積（μL）=1∶3 加入試管中，沸水浴煮 20 min 后流水冷卻。按肝糖原測定試劑盒說明書在各試管中加入各試劑，將肝糖原水解液進(jìn)一步制備成糖原原液，混勻后置沸水中煮5 min，冷卻后于620 nm 處用紫外分光光度計測得吸光度值，計算出肝糖原含量。

1.4.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用獨(dú)立樣本的t 檢驗進(jìn)行差異顯著性檢驗，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（D）表示[18]。

2 結(jié)果與討論

2.1 刺參低聚肽的質(zhì)量評價

采用復(fù)合蛋白酶制劑酶解，經(jīng)過膜分離后的刺參低聚肽呈淡黃色或黃色粉狀，具海參特有腥氣，味微苦，無霉變，無異味，無肉眼可見雜質(zhì)，各成分檢測結(jié)果見表1。

表1 刺參低聚肽的檢測結(jié)果Table 1 Detection results of Apostichopus japonicus oligopeptides

從表1 中可以看出，產(chǎn)品中總氮含量為12.3%，蛋白質(zhì)含量為76.87%，表明蛋白質(zhì)是其主要成分，水分及灰分含量較低。同時產(chǎn)品中含有鎂、磷、鉀、鋅、鐵、硒、錳等多種礦物質(zhì)以及豐富的?；撬幔；撬崾侨梭w必需的營養(yǎng)元素，具有增強(qiáng)免疫力、改善記憶、預(yù)防心血管病及糖尿病、高血壓等等重要生物學(xué)作用[19]，眾多微量元素的存在有利于人體營養(yǎng)物質(zhì)的補(bǔ)充。

刺參低聚肽的獸藥及農(nóng)藥殘留檢測項目涉及多氯聯(lián)苯類、氯霉素類、呋喃類代謝物、沙星類、磺胺類等多個指標(biāo)，結(jié)果顯示所有藥物殘留在刺參低聚肽中均未檢出，極大保證了產(chǎn)品的安全性。

急性經(jīng)口毒性試驗依照GB15193.3-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)急性經(jīng)口毒性試驗》標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測定，試驗結(jié)果顯示，樣品經(jīng)口半數(shù)致死量（LD50）＞10 000 mg/kg，根據(jù)急性毒性分級，該樣品為實際無毒，是可放心安全的產(chǎn)品。

2.2 刺參低聚肽的氨基酸組成和分子量分布

刺參低聚肽中氨基酸組成及含量見表2。

由表2 可知，刺參低聚肽中氨基酸總量為82.91%，甘氨酸含量最高，依次為谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、羥脯氨酸、脯氨酸、亮氨酸，這些氨基酸的總量為57.11%，占氨基酸總量的68.89%，其中甘氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸含量較高，表明富含膠原蛋白；甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸影響學(xué)習(xí)記憶能力，高含量的此類氨基酸有助于提高學(xué)習(xí)記憶能力[20]；富含人體必需的7 種氨基酸（不含色氨酸）和2 種半必需氨基酸（組氨酸和精氨酸），總含量為25.85%，占氨基酸總量的31.18%，必須氨基酸含量較高；呈味氨基酸甘氨酸、丙氨酸和谷氨酸和天冬氨酸含量為40.93 %，占氨基酸總量的49.37%，呈現(xiàn)出產(chǎn)品特有的鮮味。此外，支鏈氨基酸和疏水性氨基酸含量較高，分別為12.7 3%和24.6%，有研究表明，支鏈氨基酸具有獨(dú)特的生理功能，在調(diào)節(jié)免疫、抗疲勞及機(jī)體修復(fù)方面發(fā)揮重要作用[21-22]，疏水性氨基酸含量與抗氧化肽和ACE 抑制肽的活性密切相關(guān)[23-24]。

刺參低聚肽分子量分布結(jié)果見表3。

表3 刺參低聚肽分子量分布Table 3 Molecular weight distribution of Apostichopus japonicus oligopeptides

由表3 可知，分子量在1 000 Da 以下蛋白水解物占 99.58%，其中 1 000 Da～500 Da 占比 8.21%，500 Da～180 Da 占比57.44%，小于180 Da 占比33.93%，可以看出刺參低聚肽中500 Da～180 Da 的肽段比例最高，此分子量范圍內(nèi)主要由2～3 個氨基酸組成的小分子肽。研究表明分子量越小的肽，其吸收效果越好，功效越強(qiáng)[25-26]，尤其是2～3 個氨基酸組成的寡肽更容易穿越小腸粘膜直接被人體吸收利用[27-28]。因此同海參中大分子蛋白相比，刺參低聚肽產(chǎn)品屬于小分子活性肽產(chǎn)品，更易于人體的消化吸收，吸收利用率更高，尤其適合消化功能較弱的人群。

2.3 對小鼠狀態(tài)及體重的影響

刺參低聚肽、大豆低聚肽和海參粉對小鼠體重的影響見表4。

在30 d 灌胃試驗過程中，各組小鼠在試驗過程中飲食、飲水、毛發(fā)、大小便等情況均無異常。從表4 中各組小鼠受試30 d 體重增長情況可以看出，陰性對照組和實驗組小鼠體重總體上都呈增長趨勢，增長情況略有差異。經(jīng)t 檢驗發(fā)現(xiàn)，受試組與對照組之間無顯著性差異（p＞0.05）。結(jié)果表明，刺參低聚肽及大豆低聚肽、海參粉對小鼠體重均無顯著影響。

表4 刺參低聚肽、大豆低聚肽和海參粉對小鼠體重的影響（D，n=10）Table 4 The effect of Apostichopus japonicus oligopeptides，soybean oligopeptides and sea cucumber powder on body weight of mice（D，n=10）g

表4 刺參低聚肽、大豆低聚肽和海參粉對小鼠體重的影響（D，n=10）Table 4 The effect of Apostichopus japonicus oligopeptides，soybean oligopeptides and sea cucumber powder on body weight of mice（D，n=10）g

組別 灌胃前體重 1 周體重 2 周體重 3 周體重 4 周體重陰性對照 20.30±1.09 25.76±1.12 29.17±0.76 35.33±0.71 38.40±0.62刺參低聚肽低劑量 20.65±1.61 26.77±1.39 31.03±1.39 36.23±1.50 38.77±1.29刺參低聚肽中劑量 20.88±1.20 26.09±0.88 29.77±0.80 35.83±1.36 38.73±1.40刺參低聚肽高劑量 20.78±1.09 26.09±1.09 28.50±2.65 35.33±0.64 38.13±0.55大豆低聚肽低劑量 22.15±1.69 27.95±1.84 30.17±1.21 36.60±0.72 39.10±1.21大豆低聚肽中劑量 21.09±1.81 26.14±1.45 29.58±0.60 35.07±1.40 38.50±1.55大豆低聚肽高劑量 20.47±0.69 25.75±1.22 30.66±1.43 35.32±0.92 38.60±0.79海參粉低劑量 20.12±0.80 26.13±0.65 29.00±1.37 35.07±0.87 38.10±0.40海參粉中劑量 21.49±0.67 26.50±0.56 29.99±0.74 35.62±1.08 39.07±0.70海參粉高劑量 20.80±1.26 26.45±1.05 30.10±0.98 35.90±0.70 38.83±0.55

2.4 對小鼠負(fù)重游泳時間的影響

刺參低聚肽、大豆低聚肽和海參粉對小鼠負(fù)重游泳時間的影響見圖1。

圖1 刺參低聚肽、大豆低聚肽和海參粉對小鼠負(fù)重游泳時間的影響Fig.1 The effect of Apostichopus japonicus oligopeptides，soybean oligopeptides and sea cucumber powder on loaded swimming time of mice

從圖1 可以看出，與陰性對照組相比，海參粉各劑量組和對小鼠游泳時間無明顯延長，表明低、中、高劑量組海參粉均不能延長小鼠的負(fù)重游泳時間。大豆低聚肽低劑量組對小鼠游泳時間無明顯影響，而中、高劑量使小鼠的負(fù)重游泳時間明顯延長，同陰性對照組相比存在明顯差異，延長率分別為95.39%和96.16%。而刺參低聚肽低、中、高劑量組均能使小鼠的負(fù)重游泳時間明顯延長，同陰性對照品相比具有顯著差異（p＜0.05），增長率分別為93.08%、153.85%、167.31%。該結(jié)果表明刺參低聚肽能夠極大延長小鼠的負(fù)重游泳時間，提高小鼠運(yùn)動耐力，且低劑量組刺參低聚肽即可達(dá)到大豆低聚肽中、高劑量組的效果，作用強(qiáng)弱順序為：刺參低聚肽＞大豆低聚肽＞海參粉。

2.5 對運(yùn)動后小鼠血清尿素氮含量的影響

血尿素氮是蛋白質(zhì)代謝分解終產(chǎn)物，運(yùn)動后機(jī)體的血糖降低、糖原消耗，需要分解蛋白質(zhì)滿足對能量的需求，血清尿素氮作為能量代謝產(chǎn)物，是衡量機(jī)體疲勞程度的重要指標(biāo)。

刺參低聚肽、大豆低聚肽和海參粉對運(yùn)動后小鼠血清尿素氮含量的影響見圖2。

圖2 刺參低聚肽、大豆低聚肽和海參粉對運(yùn)動后小鼠血清尿素氮含量的影響Fig.2 The effect of Apostichopus japonicus oligopeptides，soybean oligopeptides and sea cucumber powder on BUN content of mice

從圖2 可以看出各實驗組小鼠運(yùn)動后的血清尿素氮含量明顯低于陰性對照組，且呈差異顯著（p＜0.05），結(jié)構(gòu)表明刺參低聚肽、大豆低聚肽和海參粉的各劑量組均能夠降低運(yùn)動后小鼠的血清尿素氮含量，其中刺參低聚肽各劑量組的效果最好，明顯低于大豆低聚肽組與海參粉組，但是，刺參低聚肽低、中、高劑量組之間差異并不明顯，這表明較低的給藥劑量即可明顯改善小鼠的血清尿素氮含量，而無需大劑量給藥，充分顯示出了刺參低聚肽活性強(qiáng)的特點(diǎn)。

2.6 對小鼠肝糖原含量的影響

運(yùn)動條件下，糖原會加速分解產(chǎn)生三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），維持機(jī)體血糖平衡。因此，糖原含量高低是機(jī)體運(yùn)動耐受力的重要標(biāo)志，也是衡量疲勞程度的一項重要指標(biāo)。

刺參低聚肽、大豆低聚肽和海參粉對小鼠肝糖原含量的影響見圖3。

圖3 刺參低聚肽、大豆低聚肽和海參粉對小鼠肝糖原含量的影響Fig.3 The effect of Apostichopus japonicus oligopeptides，soybean oligopeptides and sea cucumber powder on hepatic glycogen content of mice

從圖3 中可以看出，與陰性對照組相比，各實驗組小鼠的肝糖原含量均明顯升高，其中海參粉的作用效果最弱，其次是大豆低聚肽，刺參低聚肽效果最好，能夠極大提高小鼠肝糖原的含量，且呈極顯著性差異，而中劑量的刺參低聚肽的效果最好，與陰性對照組相比肝糖原含量增長111.92%。而高劑量組的肝糖原含量反而低于中劑量組，此結(jié)果表明并非劑量越大效果越好，中等劑量是最佳劑量，此時劑量為0.17 g/kg。

3 結(jié)論

本文對刺參低聚肽的質(zhì)量進(jìn)行整體評價，結(jié)果顯示刺參低聚肽產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量高，氨基酸種類齊全，富含有多種人體必須氨基酸、呈味氨基酸、支鏈氨基酸及疏水性氨基酸。低聚肽含量高，分子量在1 000 Da以下的蛋白水解物占99.58%，且180 Da～500 Da 的肽段比例最高。產(chǎn)品質(zhì)量符合各項指標(biāo)，含有多種礦物質(zhì)，營養(yǎng)成分全面，無重金屬超標(biāo)，無獸藥及農(nóng)藥殘留，產(chǎn)品質(zhì)量佳，食用安全。在海洋重金屬污染以及農(nóng)藥、獸藥殘留日益嚴(yán)重的當(dāng)代，開發(fā)這樣一款安全、有效、高營養(yǎng)價值的海參低聚肽產(chǎn)品是大勢所趨。

本文研究并比較了刺參低聚肽、大豆低聚肽和海參粉的抗疲勞效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組相比，刺參低聚肽使得小鼠負(fù)重游泳時間明顯延長，運(yùn)動之后的血清尿素氮含量顯著降低，體內(nèi)糖原儲備能力明顯提高，證明了刺參低聚肽具有顯著的抗疲勞功效。對比刺參低聚肽不同劑量組的實驗數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，刺參低聚肽的劑量與抗疲勞效應(yīng)不存在正相關(guān)，中劑量組的肝糖原增長率比低、高劑量組更加明顯，而各劑量組的血清尿素氮降低率無明顯差異，表明中劑量（0.17 g/kg）組的刺參低聚肽抗疲勞效果最好，為最佳劑量，此結(jié)果充分顯示刺參低聚肽并非服用越多效果越好，中劑量是最佳抗疲勞劑量，換算為人體服用劑量約為0.8 g/d，此劑量的刺參低聚肽產(chǎn)品可起到明顯的抗疲勞作用，為抗疲勞功能性食品及保健品的開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。

進(jìn)一步對比刺參低聚肽、大豆低聚肽及海參粉的抗疲勞效果，結(jié)果顯示大豆低聚肽和海參粉也具有一定的抗疲勞作用，但相同劑量時，刺參低聚肽具有最佳的抗疲勞效果且呈差異顯著，其作用強(qiáng)弱順序為：刺參低聚肽＞大豆低聚肽＞海參粉。分析海參粉作用效果弱的原因，其中一個可能是海參粉進(jìn)入機(jī)體之后需要經(jīng)過進(jìn)一步的消化才能被吸收，而低聚肽能夠直接以完整的形式被小腸上皮細(xì)胞吸收[29]，且小分子肽更易于人體的消化吸收，利用率更高。

大豆肽具有抗疲勞、抗氧化、降血糖等多種功效[30-31]，在我國嬰幼兒食品、老年食品、特殊人群營養(yǎng)補(bǔ)充劑等產(chǎn)品中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。相比大豆肽而言，海參肽的眾多功能雖然已被研究證實，但并沒有得到大規(guī)模的應(yīng)用，原因可能與刺參低聚肽的價格昂貴有極大關(guān)系。本文研究結(jié)果表明，刺參低聚肽的抗疲勞效果明顯好于大豆低聚肽，低劑量的海參肽即可起到很好的效果，此結(jié)論有助于降低海參肽的使用成本，擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，同時刺參低聚肽中富含多種人體必需氨基酸及各種營養(yǎng)物質(zhì)，為刺參低聚肽這種高價值原料的作為功能性食品尤其是抗疲勞食品的應(yīng)用提供了可靠的理論依據(jù)。

疲勞主要原因是肌體運(yùn)動時產(chǎn)生大量的自由基破壞了細(xì)胞內(nèi)外正常的物質(zhì)交換，從而使機(jī)體的能量和物質(zhì)代謝能力降低，有研究表明海參肽具有顯著的抗氧化和增強(qiáng)免疫力作用[14，32]，推出海參肽可能通過抗氧化提高機(jī)體抗氧化酶活性以及增強(qiáng)免疫力起到抗疲勞的作用，具體的作用機(jī)制還有待于今后進(jìn)一步的研究。