陳梓云，彭夢(mèng)俠，阮韻丹

（嘉應(yīng)學(xué)院化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣東梅州514015）

柑橘皮通過(guò)冷榨法、蒸餾法、冷磨法、溶劑萃取法和超臨界流體萃取法等方法，制得的具有獨(dú)特的桔子皮味的精油稱為桔子精油。常用作食品香精、化妝品香精和香水配料，此外，桔子精油清新的氣味及鎮(zhèn)靜效果，有提振精神的作用，常用于平撫沮喪與焦慮；桔子精油可以調(diào)和腸胃、也能刺激腸胃蠕動(dòng)、幫助排氣，還能鎮(zhèn)定消化道，增加胃口、刺激食欲，表現(xiàn)出良好的生理療效[1-2]。決定桔子精油品質(zhì)的主要成分是檸檬烯，還含有月桂烯、γ-萜品烯、α-蒎烯、佛術(shù)烯、芳樟醇、p-薄荷-1（7），2-二烯、香芹醇、a-松油醇等多種化合物[3]。造成桔子精油中主要成分含量差異的因素較多，如提取技術(shù)的差異、產(chǎn)地的差異等。快速有效地檢測(cè)桔子精油的主要成分的含量，是推動(dòng)精油市場(chǎng)良好發(fā)展的前提保障。

目前，檢測(cè)桔子精油成分的方法是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（gas chromatography-mass spectrometer，GCMS）[4-6]。檢測(cè)時(shí)需要對(duì)樣品進(jìn)行前處理，消耗時(shí)間較長(zhǎng)，因此無(wú)法達(dá)到快速無(wú)損檢測(cè)的效果。近年來(lái)，近紅外光譜法快速測(cè)定含量的研究越來(lái)越多，比如：蛹蟲草中腺苷含量的測(cè)定[7]、八角茴香中莽草酸含量的測(cè)定[8]、羅布麻葉中總黃酮含量的測(cè)定[9]、新疆薰衣草精油主要組分的測(cè)定[10]、羅紅霉素中兩種主要成分的測(cè)定[11]及夏枯草中水溶性浸出物的含量的測(cè)定[12]等。

本文采用近紅外光譜法（near infrared spectroscopy，NIR）結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法來(lái)建立了桔子精油快速定量的分析方法，能快速、有效地檢測(cè)桔子精油中檸檬烯的含量，判別桔子精油的品質(zhì)，對(duì)精油市場(chǎng)的有序發(fā)展具有很重要的現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用價(jià)值[13-16]。

1 儀器與試劑

1.1 儀器與設(shè)備

Antaris II 型傅立葉變換近紅外光譜儀：美國(guó)賽默飛公司；GCMS-QP2010 Ultra 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：日本島津公司。

1.2 試劑與樣品

檸檬烯標(biāo)準(zhǔn)溶液（97%）：上海麥克林生化科技有限公司；無(wú)水乙醇（分析純）：廣東光華科技股份有限公司。試驗(yàn)樣品見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)樣品Table 1 Experimental sample

2 試驗(yàn)方法

2.1 GC-MS測(cè)定桔子精油中檸檬烯的含量

色譜條件：Rxi-5SilMS 石英毛細(xì)管色譜柱；升溫程序：初始溫度50 ℃，以5 ℃/min 升溫至280 ℃并維持2 min；載氣：99.999%He；柱流量 0.95 mL/min，吹掃流量1mL/min，壓力49.5KPa，分流比100∶1；進(jìn)樣量：1μL。

質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源；電子能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；接口溫度：280 ℃；電壓：0.35 kV；質(zhì)量掃描范圍（m/z）：30～500，間隔 1 sec，掃描速度588，溶劑延遲 3.0 min。

用無(wú)水乙醇作溶劑，配制濃度分別為0、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1 mg/L 的檸檬烯標(biāo)準(zhǔn)溶液。以特征離子（檸檬烯）峰面積為縱坐標(biāo)，檸檬烯濃度為橫坐標(biāo)，繪制檸檬烯標(biāo)準(zhǔn)工作曲線見(jiàn)如圖1。

圖1 檸檬烯標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Fig.1 Limonene standard working curve

該標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R=0.996 8，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，用于桔子精油中檸檬烯含量的外標(biāo)法檢測(cè)。

稱取適量桔子精油樣品，用無(wú)水乙醇稀釋至1 mg/L。在色譜和質(zhì)譜條件與制作檸檬烯標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)的條件相同的情況下，測(cè)定J1～J10 桔子精油樣品。根據(jù)待測(cè)樣品桔子精油中檸檬烯的峰面積，即可在外標(biāo)檸檬烯標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上得出桔子精油中檸檬烯的含量。

2.2 桔子精油近紅外光譜的采集

近紅外光譜測(cè)定條件：以空氣做背景，采用AntarisⅡ傅立葉近紅外光譜儀的液體透射附件采樣，使用6 mm 光程樣品管，設(shè)置波數(shù)范圍10 000 cm-1～4 000 cm-1，掃描次數(shù) 32 次，分辨率 8 cm-1。

取1 mL 桔子精油樣品于液體樣品管中，在同一環(huán)境溫度濕度條件下，以空氣為背景，采集不同種類的桔子精油J1～J10 的近紅外光譜圖。每種桔子精油取5 個(gè)樣品，每個(gè)樣品測(cè)3 張譜圖，每種桔子精油測(cè)15 張譜圖。選用RESULT-Integration 軟件、RESULTOperation 軟件采集桔子精油的近紅外譜圖保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 桔子精油中檸檬烯含量的近紅外定量分析模型的建立

在10 種不同的桔子精油樣品的近紅外光譜圖中，各取9 張譜圖，共90 張譜圖為建模校正集樣品譜圖；各選取1 張譜圖，共10 張為驗(yàn)證集樣品譜圖，進(jìn)行內(nèi)部檢驗(yàn)。將上述100 張譜圖導(dǎo)入TQ Analyst 9.0 軟件，選用偏最小二乘法（partial least square，PLS）建立定量分析模型。光程差設(shè)為常數(shù)；尋找最佳的建模光譜范圍及最佳的光譜預(yù)處理方式；剔除可疑樣品；優(yōu)化該定量模型。用其校正相關(guān)系數(shù)RC、校正均方差（root mean square error of calibration，RMSEC）；預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù) RP、預(yù)測(cè)均方差（root mean square error of prediction，RMSEP）；交互驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)RV、交互驗(yàn)證均方差（root mean square error of cross validation，RMSECV） 來(lái)評(píng)估定量模型的優(yōu)劣。

2.4 模型的應(yīng)用

用2.3 所建模型，檢測(cè)10 種桔子精油樣品的檸檬烯含量。將每種桔子精油余下未參與建模的5 張近紅外譜圖，共50 張譜圖作為待測(cè)集樣品譜圖，導(dǎo)入模型進(jìn)行檢測(cè)。用各種精油樣品的檸檬烯實(shí)際含量（GC-MS測(cè)定）與模型預(yù)測(cè)值之間的相對(duì)誤差，對(duì)定量分析模型的準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)估。

3 結(jié)果與討論

3.1 GC-MS測(cè)定桔子精油中檸檬烯含量的結(jié)果

用2.1 的方法測(cè)得J1～J10 桔子精油樣品中檸檬烯的含量，分別為 68.5%、71.6%、63.9%、80.2%、72.1%、62.6%、79.8%、71.6%、68.6%、62.1%。

3.2 桔子精油的近紅外光譜的對(duì)比

將參與建模的J1～J10 的100 張桔子精油樣品的近紅外光譜圖，置于同一窗口，如圖2 所示。

由圖2 可知，10 種桔子精油的近紅外光譜圖相似程度很高。因受實(shí)驗(yàn)室條件的限制，只有光程差較長(zhǎng)的樣品管，所測(cè)近紅外光譜圖最大吸收峰的吸光度偏高，建模時(shí)所選波段的吸光度值要盡量小于3。

圖2 桔子精油樣品的近紅外光譜圖Fig.2 Near-infrared spectrum of orange essential oil samples

3.3 建立測(cè)定桔子精油中檸檬烯含量的定量分析模型

將2.3 選定的訓(xùn)練集樣品、預(yù)測(cè)集樣品的近紅外譜圖，導(dǎo)入TQ Analyst 軟件，選偏最小二乘法（PLS）進(jìn)行建模。在預(yù)覽模型中，剔除8 個(gè)異常數(shù)據(jù)譜圖，其中包括7 個(gè)為訓(xùn)練集數(shù)據(jù)譜圖，1 個(gè)為驗(yàn)證集數(shù)據(jù)譜圖，最終以93 個(gè)訓(xùn)練集數(shù)據(jù)建立了測(cè)定桔子精油中檸檬烯含量的定量分析模型；9 個(gè)驗(yàn)證集數(shù)據(jù)為模型內(nèi)部驗(yàn)證集樣品。

經(jīng)多次篩選得到了建模的最佳光譜范圍，即：同時(shí)選擇 6040.58cm-1～6677.65 cm-1、5 857.66 cm-1～5 657.32 cm-1、4 882.88 cm-1～4 801.88 cm-13 段波譜作為建模光譜范圍。在選定的建模光譜范圍的基礎(chǔ)上，對(duì)建模的光譜預(yù)處理方式的進(jìn)行篩選，用其校正相關(guān)系數(shù)（RC）、校正均方差（RMSEC）、預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)（RP）、預(yù)測(cè)均方差（RMSEP）、交互驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)（RV）、交互驗(yàn)證均方差（RMSECV）、模型的性能指數(shù)來(lái)評(píng)估定量模型的優(yōu)劣。具體指標(biāo)見(jiàn)表2。

比較表2 中數(shù)據(jù)，某種預(yù)處理方式對(duì)應(yīng)的RC、RP、RV3 種相關(guān)系數(shù)越接近 1，RMSEC、RMSEP、RMSECV3種均方差越小，且數(shù)據(jù)相近；性能指數(shù)越小，則對(duì)應(yīng)所建模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性越好，模型的穩(wěn)定性越好。由表2得出了建模的最佳預(yù)處理方式為一階導(dǎo)數(shù)（SG 濾燥）。

表2 不同光譜預(yù)處理方式下模型的相關(guān)系數(shù)及均方差Table 2 The correlation coefficient and mean square error of models under different spectral pretreatment methods

在上述所選的建模的最佳光譜范圍及最佳預(yù)處理方式下建模，得到了模型近紅外光譜（NIR）計(jì)算值與標(biāo)準(zhǔn)值之間的相關(guān)圖，見(jiàn)圖3，圖4。

圖3 NIR 計(jì)算值與標(biāo)準(zhǔn)值之間的相關(guān)圖（含內(nèi)部驗(yàn)證）Fig.3 Correlation diagram between NIR calculated values and standard values（including internal verification）

圖4 NIR 計(jì)算值與標(biāo)準(zhǔn)值之間的交互驗(yàn)證相關(guān)圖Fig.4 Interaction verification correlation diagram between NIR calculated values and standard values

所建模型的 RC為 0.997 7、RMSEC 為 0.412；RP為0.998 2、RMSEP 為 0.396；RV為 0.994 0、RMSECV 為0.662；模型的性能指數(shù)為94.7。所建模型誤差分布圖見(jiàn)圖5。

圖5 NIR 預(yù)測(cè)值與標(biāo)準(zhǔn)值之間的誤差分布圖Fig.5 Error distribution between NIR predicted values and standard values

從圖5 可知，所建模型NIR 預(yù)測(cè)值與標(biāo)準(zhǔn)值之間的誤差在-0.8%～1.2%之間。所建模型具有良好的預(yù)測(cè)能力及穩(wěn)定性。

3.4 定量分析模型的應(yīng)用

取J1～J10 桔子精油的50 個(gè)待測(cè)集樣品的近紅外光譜圖，導(dǎo)入所建模型中，用模型預(yù)測(cè)其檸檬烯的含量。真實(shí)值采用GC-MS 測(cè)定J1～J10 桔子精油檸檬烯含量的平均值。通過(guò)驗(yàn)證集樣品真實(shí)值與預(yù)測(cè)值的誤差來(lái)驗(yàn)證定量分析模型的準(zhǔn)確性。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品中檸檬烯的真實(shí)值與驗(yàn)證集樣品的預(yù)測(cè)值Table 3 The true value of limonene in the sample and the predicted value of the proof set sample

續(xù)表3 樣品中檸檬烯的真實(shí)值與驗(yàn)證集樣品的預(yù)測(cè)值Continue table 3 The true value of limonene in the sample and the predicted value of the proof set sample

結(jié)果顯示，預(yù)測(cè)J1～J10 桔子精油的檸檬烯含量的平均誤差為0.2%～1.1%，相對(duì)誤差為0.3%～1.5%，表明模型具有良好的預(yù)測(cè)效果。

4 結(jié)論

采用近紅外光譜分析技術(shù)獲取桔子精油的光譜信息，結(jié)合偏最小二乘法（PLS）回歸分析提取光譜信息中的差異，通過(guò)化學(xué)計(jì)量學(xué)將光譜信息差異與對(duì)應(yīng)的檸檬烯測(cè)定值關(guān)聯(lián)，建立桔子精油中檸檬烯含量的近紅外定量分析模型。所建模型的校正相關(guān)系數(shù)RC為0.997 7、校正均方差RMSEC 為0.412；預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)RP為 0.998 2、預(yù)測(cè)均方差 RMSEP 為 0.396；交互驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)RV為0.994 0、交互驗(yàn)證均方差RMSECV 為0.662；模型的性能指數(shù)為94.7。模型NIR 預(yù)測(cè)值與標(biāo)準(zhǔn)值之間的誤差在-0.8%～+1.2%之間。所建模型有良好的預(yù)測(cè)能力及穩(wěn)定性。近紅外光譜技術(shù)結(jié)合偏最小二乘法（PLS）可以快速檢測(cè)桔子精油中檸檬烯的含量，模型準(zhǔn)確度高。