任建國(guó) 王益 劉紅美

摘要：種植經(jīng)多功能菌肥拌種處理的太子參種根，收獲后分析太子參塊根長(zhǎng)度、生物量及主要品質(zhì)指標(biāo)，以研究其對(duì)太子參生長(zhǎng)發(fā)育和品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，與未經(jīng)菌肥處理的對(duì)照相比，菌肥處理過(guò)的太子參塊根生物量明顯增加;塊根的氨基酸、皂苷含量及微量元素Mn、Fe含量分別增加243.3%、119.8%、2.1%和13.1%，而多糖、環(huán)肽含量及微量元素Cu、Zn含量差異不大。多功能菌肥的施用能改善太子參塊根的品質(zhì)，提高其藥用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：太子參;菌肥;品質(zhì);生物量

中圖分類(lèi)號(hào)：S567.5+30.6 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）07-0116-04

太子參[Pseudostellaria heterophylla （Miq.） Pax]為一種藥食兩用的中藥材，含有多糖、環(huán)肽、氨基酸、皂苷、微量元素、揮發(fā)性成分等[1]，臨床上用于治療脾虛體倦、食欲不振、病后虛弱等癥，而作為保健食品的有復(fù)方太子參顆粒、太子參口服液（太子寶）、什錦太子參酥脆和姜汁太子參酥等[2]。菌肥是利用微生物的生命活動(dòng)及代謝產(chǎn)物，為農(nóng)作物提供營(yíng)養(yǎng)元素、生長(zhǎng)物質(zhì)，以達(dá)到調(diào)控生長(zhǎng)、提高產(chǎn)量、改善品質(zhì)、減少化肥使用量及提高土壤肥力的目的。菌肥在作物上的應(yīng)用較多，尤其是禾谷類(lèi)作物，如水稻[3]、小麥[4-6]、玉米[7]等，而在經(jīng)濟(jì)作物煙草、茶及中草藥等[8]上應(yīng)用較少。左群等采用L9（34）正交試驗(yàn)研究不同菌肥[恩益碧（NEB）母液、重茬一號(hào)和彤?huà)删蔧、不同施用量和不同施用方式（拌種、拌肥和直接施肥）對(duì)連作太子參產(chǎn)量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌肥的施用方式對(duì)太子參產(chǎn)量影響最明顯，其次為施肥量[9]。陸志平用由巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）、解磷細(xì)菌（Bacillus megaterium）、鉀細(xì)菌（Bacillus mucilaginosus）組成的復(fù)合菌劑增施于太子參種植中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌劑能夠提高太子參產(chǎn)量，但因不同劑量基肥和追肥的施用其增產(chǎn)效果有所不同[10]。上述所有文獻(xiàn)都沒(méi)有關(guān)于菌肥對(duì)太子參品質(zhì)影響的相關(guān)研究報(bào)道，為此本試驗(yàn)就自制菌肥對(duì)太子參生長(zhǎng)、品質(zhì)的影響進(jìn)行相關(guān)研究，以期為菌肥在太子參種植中的推廣施用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料和試劑 自制太子參菌肥（未進(jìn)行菌株鑒定）：由促生菌KTS-1-1（具有抗根腐病、解鉀功能，用字母A代表）、TR-10J（具有溶磷功能）、ATS-1-1（具有固氮功能）、ATR-2-3（具有固氮功能）、PTS-2-1（具有溶磷功能）組成的菌液[11];普通復(fù)合肥：西洋復(fù)合肥（貴州西洋肥業(yè)有限公司，總養(yǎng)分含量≥45%，氮 ∶ 磷 ∶ 鉀=13 ∶ 17 ∶ 15）;磷肥：鈣鎂磷（江西江磷磷肥有限公司，養(yǎng)分含量≥12%）;鉀肥：硫酸鉀（江蘇邳州蘇北肥料有限公司，氧化鉀含量≥50%）;

試劑：人參皂苷Rbl，購(gòu)自北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司;L-亮氨酸、D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;其他試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器 contrAA700型火焰原子吸收光譜儀，德國(guó)耶拿公司;R-3型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士步琦公司;721分光光度計(jì)，上海第三分析儀器廠(chǎng)。

1.2 方法

1.2.1 菌肥施用及太子參生物性狀測(cè)定 選取大小一致的健康種根作為種子進(jìn)行種植，試驗(yàn)設(shè)置菌肥拌種（處理）和非拌種（對(duì)照）2種處理，于2016年1月在貴州省施秉縣牛大場(chǎng)鎮(zhèn)中藥材種植基地進(jìn)行。用3×108 CFU/mL菌肥液噴濕種根表面，風(fēng)干后再排種。每處理3次重復(fù)，小區(qū)面積為 10 m2（10 m×1 m），共6個(gè)小區(qū)。種植條件與常規(guī)生產(chǎn)模式相同，施用基肥量為300 kg/hm2普通復(fù)合肥、750 kg/hm2磷肥、150 kg/hm2 鉀肥。各處理用450 kg/hm2復(fù)合肥按1 kg ∶ 75 L兌水成稀肥液澆施，作為追肥。試驗(yàn)期間其他管理?xiàng)l件相同。太子參收獲后，測(cè)量太子參塊根長(zhǎng)度;將塊根烘干至恒質(zhì)量后測(cè)其干質(zhì)量。

1.2.2 塊根氨基酸含量測(cè)定 太子參收獲后采取不同處理小區(qū)的塊根樣品混合后，用重蒸水沖洗干凈，室溫晾干后置于60 ℃恒溫干燥箱烘干至恒質(zhì)量，研磨成粗粉后儲(chǔ)存于干燥器內(nèi)備用。塊根氨基酸含量的測(cè)定參考文獻(xiàn)[12]。取1.0 g塊根粗粉置于25 mL大試管中，加入20 mL 95%的乙醇，密塞;將試管置于70 ℃水浴鍋中保溫30 min，隨后取出25 mL大試管靜置冷卻至室溫，最后定容至25 mL;將上層清液用濾紙過(guò)濾，濾液即可用于測(cè)定氨基酸含量。每個(gè)處理重復(fù)3次。

取質(zhì)量濃度為0、1、5、10、15、20、25 μg/mL的亮氨酸（選取人體必須氨基酸之一的亮氨酸來(lái)表征塊根中總氨基酸的相對(duì)含量）溶液 1 mL，分別加入3 mL 0.1%茚三酮試劑（0.1 g茚三酮溶于100 mL 95%乙醇溶液）及0.1 mL 0.1%抗壞血酸，于沸水中保持 15 min，用95%乙醇補(bǔ)足失去的體積，于580 nm處測(cè)定吸光度后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

吸取樣品濾液1 mL，加入3 mL 0.1%茚三酮試劑及 0.1 mL 0.1%抗壞血酸，于沸水中保持15 min，用95%乙醇補(bǔ)足失去的體積，于580 nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)樣品的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查得樣品液氨基酸含量，然后根據(jù)下式計(jì)算塊根氨基酸含量。

每克粗粉樣品中氨基酸含量=（ρ×V1）/（m×D1）。其中，ρ為樣品液中測(cè)得的氨基酸質(zhì)量濃度，μg/mL;V1為提取液的體積，本試驗(yàn)為25 mL;m為粗粉質(zhì)量，g;D1為粗粉中干物質(zhì)含量，%。

1.2.3 塊根多糖含量測(cè)定 塊根多糖含量的測(cè)定參考文獻(xiàn)[13]，稍有改動(dòng)。取10 g塊根粗粉，置于100 mL圓底燒瓶中，加入80 mL 80%乙醇在90 ℃下回流提取5次。藥渣中加入80 mL蒸餾水在90 ℃水浴鍋中提取1 h，趁熱過(guò)濾，藥渣加蒸餾水洗滌數(shù)次，洗液并入濾液，冷卻后移入100 mL容量瓶中，最后用蒸餾水定容備用。每個(gè)處理重復(fù)3次。

取2 mL質(zhì)量濃度分別為0、8、16、24、32、40 μg/mL的葡萄糖溶液于各試管中，加入1.0 mL 6%苯酚試液搖勻，再迅速滴加濃硫酸5.0 mL，搖勻后放置5 min，再在沸水浴中加熱 15 min，取出冷卻至室溫，于490 nm處測(cè)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

吸取供試液0.5 mL置于具塞試管中，加入蒸餾水至 2.5 mL，另取2.5 mL蒸餾水作空白對(duì)照，各管均加入1.0 mL 6%苯酚試液搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0 mL，搖勻后靜置 5 min，再置于沸水浴中加熱15 min，冷卻至室溫，于490 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)可計(jì)算得供試液中葡萄糖的濃度，樣品中多糖含量計(jì)算公式：多糖的含量=C×D2×f×V2÷m1×100%。其中，m1為供試塊根質(zhì)量，μg;C為多糖稀釋液中葡萄糖的濃度，μg/mL;D2為多糖的稀釋因素（常數(shù)），V2為定容體積，mL;f為換算因素，常數(shù)。

1.2.4 塊根皂苷含量測(cè)定 塊根皂苷提取及含量測(cè)定參考文獻(xiàn)[14]，稍有改動(dòng)。精密稱(chēng)取太子參粗粉2.0 g，加20 mL蒸餾水稀釋?zhuān)曁崛?0 min，緩緩加入乙醇，使含醇量達(dá)70%;靜置過(guò)夜，抽濾，減壓濃縮至干，以30 mL蒸餾水溶解殘?jiān)?，?0 mL水飽和的正丁醇分3次萃取，萃取液合并后再以50 mL正丁醇飽和的蒸餾水洗滌1次，減壓濃縮至干，殘?jiān)约状既芙獠⒍ㄈ葜?0 mL，即得待測(cè)的總皂苷甲醇溶液。每個(gè)處理重復(fù)3次。

取100 ℃干燥至恒質(zhì)量的人參皂苷Rbl對(duì)照品10 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度配成標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)液10、20、40、80、160 μL，分別置于10 mL具塞試管中，用微熱風(fēng)吹去溶劑，加5%香草醛冰醋酸溶液 0.2 mL、高氯酸（70%～72%）0.8 mL，混勻后密塞。置60 ℃水浴中加熱 15 min 后立即用流水冷卻，加冰醋酸5 mL，搖勻，與空白對(duì)照均于560 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

精密移取所得皂苷的甲醇溶液50 μL，置于10 mL具塞試管中，用水浴鍋加熱除去溶劑，加5%香草醛冰醋酸溶液 0.2 mL、高氯酸（70%～72%）0.8 mL，混勻并密塞。置60 ℃水浴中加熱15 min后立即用流水冷卻，加冰醋酸5 mL，搖勻，與空白對(duì)照均于560 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)可得試液中總皂苷的濃度，再計(jì)算樣品中皂苷的含量。

1.2.5 塊根環(huán)肽含量測(cè)定 塊根環(huán)肽提取參考文獻(xiàn)[15]，稍有改動(dòng)。稱(chēng)取1.0 g干燥粉末樣品，用50 mL甲醇超聲提取45 min，過(guò)濾，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，用甲醇溶解定容至10 mL容量瓶中，使用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取濾液作為供試樣品溶液。

分別取濃度為200 μg/mL的亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于25 mL的具塞比色管中，加入1 mL pH值為6.8的磷酸緩沖液和1 mL茚三酮顯色劑（0.02 g/mL），于沸水中水浴15 min，取出置冷水中水浴15 min，加入5 mL的碘酸鉀（2 g/L），用蒸餾水定容至10 mL，搖勻。在576 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

環(huán)肽含量的測(cè)定參考文獻(xiàn)[16]，稍有改動(dòng)。分別吸取6個(gè)250 μL的供試樣品溶液，向其中3個(gè)樣品溶液中加入 4 mL 1.2 mol/L的HCl，另3個(gè)中加入等量的蒸餾水，于90 ℃水解2 h，取出后用2 mol/L的NaOH中和加HCl的溶液至pH值在5～7之間，然后用蒸餾水定容至10 mL，搖勻后取1 mL于25 mL的比色管中，加入1 mL pH值為6.8的磷緩沖酸液和1 mL茚三酮顯色劑（0.02 g/mL），于沸水中水浴15 min，取出置冷水中水浴15 min，加入5 mL的碘酸鉀（2 g/L），用蒸餾水定容至10 mL，在576 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得酸解后樣品溶液中亮氨酸濃度，減去未經(jīng)酸解（蒸餾水）亮氨酸濃度即可得經(jīng)環(huán)肽水解釋放出亮氨酸的量（間接反應(yīng)環(huán)肽含量），再通過(guò)換算獲得塊根中環(huán)肽（亮氨酸）含量的大小。

1.2.6 塊根微量元素含量測(cè)定 塊根中Zn、Fe、Cu、Mn含量測(cè)定參考文獻(xiàn)[17]，稍有改動(dòng)。稱(chēng)取4份樣品各0.100 0 g，置于50 mL燒杯中，加6 mL HNO3和2 mL H2O2放置過(guò)夜，于微波消解儀中消解，用蒸餾水清洗消解管，待冷卻至室溫后用蒸餾水定容至10 mL待分析用。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法分別測(cè)定Zn、Fe、Cu、Mn元素含量，在優(yōu)化工作條件[17]下對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定。由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)可得分析液中微量元素的濃度，再換算出樣品中微量元素的含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

采用Excel 2007、SAS 8.1軟件對(duì)本試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌肥對(duì)太子參生物性狀的影響

由圖1可知，經(jīng)菌肥拌種處理（處理）的塊根平均長(zhǎng)度與未經(jīng)菌肥處理（對(duì)照）的塊根平均長(zhǎng)度差異不顯著，但在單個(gè)塊根干質(zhì)量方面，處理顯著高于對(duì)照表明，菌肥與化肥配施能增加單個(gè)塊根產(chǎn)量，有明顯的增產(chǎn)作用，這與張禮維等的研究結(jié)果[18-19]相似。另外，本試驗(yàn)結(jié)果也表明，處理與對(duì)照在單個(gè)塊根質(zhì)量上的差異與菌肥拌種所起的作用相關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果可為降低化學(xué)肥料污染、保證農(nóng)業(yè)可持續(xù)生產(chǎn)提供實(shí)踐方案。

2.2 菌肥對(duì)塊根氨基酸含量的影響

由圖2可知，處理和對(duì)照塊根中氨基酸含量分別為 18.24、5.31 mg/g，處理氨基酸含量約是對(duì)照的3.4倍，顯著高于對(duì)照;表明菌肥拌種處理能提高太子參塊根氨基酸含量。張桂華等用988生物菌肥拌種處理玉米魯原單22和登海11，與未經(jīng)拌種處理的玉米相比，其產(chǎn)量以及賴(lài)氨酸、粗蛋白、粗淀粉、粗脂肪含量均有增加[20]。左燁研究發(fā)現(xiàn)，菌肥與化肥配施對(duì)大棚辣椒產(chǎn)量和品質(zhì)[氨基酸、維生素C含量]提高效果明顯[21]。本試驗(yàn)與上述試驗(yàn)均表明，菌肥能改善作物產(chǎn)量和品質(zhì)。

2.3 菌肥對(duì)塊根多糖含量的影響

由圖3可知，處理和對(duì)照塊根的多糖含量分別為 8.31%、8.01%，處理的含量稍高于對(duì)照。田雪蓮等的研究表明，與使用化肥相比，微生物菌肥+化肥混施能提高番茄產(chǎn)量以及果實(shí)總糖含量，而株高、開(kāi)展度、莖粗、維生素C含量、可溶性固性物含量、番茄紅素含量等指標(biāo)基本沒(méi)有改變[22]，本試驗(yàn)在太子參塊根產(chǎn)量、糖含量方面的試驗(yàn)結(jié)果與之相似，進(jìn)而說(shuō)明微生物菌肥在改善植物產(chǎn)量和品質(zhì)方面有正向的作用。

2.4 菌肥對(duì)塊根皂苷含量影響

由圖4可知，處理和對(duì)照塊根中皂苷含量分別為 2.22%、1.01%，兩者含量間存在顯著差異。前人的研究表明，耕作制度、施肥類(lèi)型[23]、氮磷鉀（NPK）肥料用量[24]等均會(huì)影響植物體內(nèi)皂苷的含量，而本試驗(yàn)則發(fā)現(xiàn)，菌肥的施用有助于提高常規(guī)施肥水平下太子參塊根皂苷的含量，這可為太子參優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)提供合理的栽培管理技術(shù)。

2.5 菌肥對(duì)塊根環(huán)肽含量的影響

由圖5可知，處理和對(duì)照塊根中環(huán)肽（亮氨酸）含量分別為0.007 43%、0.007 95%，處理的環(huán)肽（亮氨酸）含量略低于對(duì)照。表明微生物菌肥的施用并不一定有助于植物特定化學(xué)成分含量的提高，這與Kandeel等的研究結(jié)果[25]相似。

2.6 菌肥對(duì)塊根微量元素含量的影響

表1表明，處理的微量元素Mn、Fe含量顯著高于對(duì)照，而二者Cu、Zn的含量差異不顯著，說(shuō)明菌肥處理對(duì)太子參塊根中微量元素Mn、Fe的含量有提升作用。Yildirim等聯(lián)合應(yīng)用根際促生菌和氮肥來(lái)研究其對(duì)結(jié)球甘藍(lán)（Brassica oleracea var. capitata L.）生長(zhǎng)、產(chǎn)量和化學(xué)組分的影響，結(jié)果表明，與未施用微生物的對(duì)照相比，促生菌的施用（浸種或幼苗沾根）對(duì)植株生長(zhǎng)、產(chǎn)量以及體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)元素N、Na、K、Ca、Mg、P、Fe、Cu、M、Zn的含量增加均有促進(jìn)作用，這種促進(jìn)作用因營(yíng)養(yǎng)元素和促生菌施用方法的不同而有所不同，一般來(lái)說(shuō)，通過(guò)促生菌幼苗沾根處理的植株葉片營(yíng)養(yǎng)元素含量大于浸種處理，而Cu、Zn則通過(guò)浸種處理獲得最大含量，Mn含量則表現(xiàn)為由于促生菌的處理而下降[26]。本試驗(yàn)所得到的太子參塊根Mn、Cu、Zn含量變動(dòng)情況與之不同，其原因可能與施用的促生菌種類(lèi)、植物種類(lèi)、化學(xué)肥料等多個(gè)因素有關(guān)。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在太子參常規(guī)種植中（施用化學(xué)肥料），增加菌肥拌種處理措施不僅能提高太子參生物量，還對(duì)太子參品質(zhì)（氨基酸、皂苷、多糖含量及微量元素Mn、Fe含量）有改善作用，這與黃冬壽在太子參上施用菌肥的研究結(jié)果[27]相似。除此之外，菌肥的拌種增產(chǎn)效果在其他作物，如小麥[28]、青稞以及豌豆等[29]上均有報(bào)道。在所有這些研究報(bào)道中，菌肥拌種對(duì)植物產(chǎn)生的促生作用與菌肥功能微生物在土壤地力和肥料養(yǎng)分利用率方面的改善是分不開(kāi)的[30]。而本試驗(yàn)結(jié)果顯示的菌肥促生功能，與菌肥中不同功能微生物的固氮、溶磷、解鉀、抑制太子參根腐病原菌的作用[11]密不可分。

菌肥的增施不但能穩(wěn)定植物產(chǎn)量，且對(duì)植物品質(zhì)也產(chǎn)生一定的影響。如木霉屬（Trichoderma）菌肥與適當(dāng)比例的N、P、K復(fù)合肥配合施用能獲得高于單施N、P、K復(fù)合肥的番茄產(chǎn)量，且使果實(shí)品質(zhì)（全糖、維生素C、β-胡蘿卜素、番茄紅素等含量）有所改善[31]。而范新翔等的研究結(jié)果表明，菌肥拌種不僅能促進(jìn)辣椒和小白菜植株生長(zhǎng)、根系發(fā)達(dá)、根莖加粗、分枝數(shù)增加、開(kāi)花提前和花蕾數(shù)增多等，而且對(duì)提高產(chǎn)量和改善品質(zhì)也有明顯效果[32]。Su等對(duì)經(jīng)過(guò)印度梨形孢（Piriformospora indica）處理的歐洲油菜（Brassica napus L.）植株的品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，印度梨形孢能增加N、Ca、Mg、P、K、S、B、Fe、Zn元素的含量，但降低芥子酸、芥子油甙的含量，進(jìn)一步的實(shí)時(shí)定量PCR分析結(jié)果表明，與芥子酸合成相關(guān)的2個(gè)代謝酶基因Bn-FAE1和BnECR的表達(dá)量下調(diào)[33]。在本試驗(yàn)中，菌肥拌種對(duì)太子參品質(zhì)有改善作用，可提高太子參塊根氨基酸、多糖、皂苷、Mn、Fe含量，但其具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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