田梓琪，李峰*，許亮，李軍德，張?zhí)?/p>

1.遼寧中醫(yī)藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600；2.中國中醫(yī)科學院 中藥資源中心，北京 100700

中國林蛙RanatemporariachensinensisDavid，別名哈士蟆，為蛙科林蛙屬動物，其雌蛙的干燥輸卵管是名貴中藥材哈蟆油[1]。關于中國林蛙的品種與分類問題一直爭議不斷，現(xiàn)在較普遍的觀點是中國林蛙分為4個亞種，即中國林蛙指名亞種R.chensinensischensinensisWei et Chen、中國林蛙蘭州亞種R.chensinensislanzhouensisWei et Chen，subsp.nov.、中國林蛙康定亞種R.chensinensiskangdingensisWei et Chen，subsp.nov.、中國林蛙長白山亞種R.chensinensischangbaishanensisWei et Chen，subsp.nov.[2]，與歷版《中華人民共和國藥典》收載的哈蟆油原動物基原存在一定分歧。由于野生中國林蛙為國家二級保護動物[3]，為解決東北道地藥材哈蟆油的來源問題，了解中國林蛙的人工馴養(yǎng)情況，本研究于2018年4—10月，對遼寧、吉林兩省中國林蛙的人工馴養(yǎng)情況進行了跟蹤調(diào)查。

1 調(diào)查內(nèi)容

本研究以遼寧、吉林兩省具有一定規(guī)模的中國林蛙(以下簡稱“林蛙”)馴養(yǎng)企業(yè)為例，重點對林蛙的生態(tài)環(huán)境與人工馴養(yǎng)中的孵化、繁育、放養(yǎng)、越冬等各階段情況進行實地調(diào)查。本研究主要關注人工馴養(yǎng)中的產(chǎn)卵期繁育技術(shù)、蝌蚪期幼體食物飼養(yǎng)、病蟲害防治、夏季幼蛙放養(yǎng)及越冬期技術(shù)情況等內(nèi)容。

2 調(diào)查結(jié)果

2.1 種群分布

0根據(jù)對調(diào)查的林蛙馴養(yǎng)企業(yè)中林蛙的體型、皮膚顏色及其外觀特征分析，其應屬于中國林蛙長白山亞種[4]，主要分布在東北長白山、大小興安嶺腹地及余脈各地，即遼寧省東北部、吉林省中部、黑龍江省南部、內(nèi)蒙古自治區(qū)東部等地區(qū)。

2.2 生態(tài)環(huán)境

林蛙主要分布地區(qū)處于中溫帶、暖溫帶，屬于溫帶季風氣候；林蛙所在地區(qū)森林類型為針葉闊葉混交林或闊葉混交林(雜木林)，具有喬木層、灌木層、草本植物及枯枝落葉層，少數(shù)林蛙分布于灌叢和林間農(nóng)田(分別為“林下林蛙”和“稻田林蛙”)。林蛙的馴養(yǎng)場通常設在N40°～45°、E120°～130°，海拔500～800 m，夏季平均氣溫20～25 ℃的峽谷或具有溝渠的環(huán)境內(nèi)，峽谷坡度在10°～40°，坡長不低于1000 m，且溝內(nèi)有常年流水的河流或小溪，沿水流邊緣附近地勢平坦，夏季草木茂盛，昆蟲眾多，森林郁閉度在0.7以上，林下相對濕度在70%以上。馴養(yǎng)場及附近無工業(yè)污染，空氣質(zhì)量達到環(huán)境空氣質(zhì)量標準[5]。

2.3 基礎設施

林蛙馴養(yǎng)企業(yè)的基礎設施多采用“三池一房”(即產(chǎn)卵池、孵化池、越冬池、看護房)或“一池多用”(即建設適用于多種用途的池塘)的建設方式，并可根據(jù)當年產(chǎn)卵的數(shù)量，配備與之相應的孵化池面積。近幾年也出現(xiàn)整體改造河道，建設林蛙馴養(yǎng)生態(tài)園林的生態(tài)馴養(yǎng)基地。在夏季溫度過高時，可架設遮蔭的設施，防止蝌蚪生病，同時防止雞鴨鳥類物種侵食蝌蚪。

2.4 引種與留種

一般在春季把生命體征良好的種蛙引入當?shù)胤N蛙群中，或直接投入優(yōu)質(zhì)卵團，以改善種群基因多樣性。留種工作在每年初冬或次年春季進行。種蛙要求發(fā)育良好，身體健壯，無損傷，動作靈活；雄蛙2年生以上，背部皮膚黑褐色并有黑斑，肩部有“∧”型黑色條紋；雌蛙2～3年生。大小相近的種蛙按雄蛙與雌蛙比例1～1.2∶1進行馴養(yǎng)。

2.5 產(chǎn)卵與孵化控制

產(chǎn)卵前期水溫需在8～10 ℃，以控制種蛙交配進程。產(chǎn)出的卵團撈出后，應立即送至孵化池或產(chǎn)卵箱，并控制密度在5個卵團/m2。孵化的受精卵大約10 d出現(xiàn)尾芽；目前孵化率一般為85%～95%。為防止氣溫驟降，應保持卵團處于水面以下，可將產(chǎn)卵箱放置于水下20～30 cm處，箱與箱間距50 cm以上。在4月中下旬，由于氣溫較低且天氣變化較大，池內(nèi)的水應5 d更新1次(水溫過高可加大排水，水溫低時則應減少更新次數(shù))。氣溫超過20 ℃后應及時降溫，可采用遮蔭與換水相結(jié)合的方式，以防蝌蚪生病。

2.6 變態(tài)期飼養(yǎng)

此飼養(yǎng)期的水深應在20～35 cm；投放密度為20 d前密度為1000～1500只/m2，20 d后密度降至800～1000只/m2；蝌蚪長大后應及時分開，以防止相互蠶食；保持水的平緩流動，水溫控制在10～20 ℃；池內(nèi)水保持2～3 d更新1次，20 d后應加大換水頻次1～2 d更新1次。此階段需要注意的是避免水溫偏高，高水溫可導致蝌蚪發(fā)育速度過快，使得變態(tài)后幼蛙體質(zhì)較弱而死亡。

2.7 病蟲害防治

本著“檢、隔、封、消、治”的原則，以預防為主，每15 d定期用殺蟲及滅菌類藥物進行全池潑灑，預防疾病的發(fā)生。發(fā)現(xiàn)病害及時隔離并消毒處理；用藥前進行預實驗，證明無害或毒性消失后方可大量用藥。在投放預防或治療性藥物時，投放前后都應注意對所使用的設備進行徹底消毒。

2.8 水質(zhì)監(jiān)控

在產(chǎn)卵、孵化及變態(tài)期的飼養(yǎng)中，水質(zhì)監(jiān)控為主要的環(huán)節(jié)，此環(huán)節(jié)應保證水質(zhì)透明、無有害物質(zhì)[6]。水質(zhì)監(jiān)控的主要方法是對池水進行消毒和加灌潔凈水，并定期使用光合細菌、EM微生物制劑等水質(zhì)凈化劑對池水進行凈化[7-8]。水質(zhì)調(diào)節(jié)劑的使用應根據(jù)不同季節(jié)和不同發(fā)育期進行選擇，不同類型調(diào)節(jié)劑的適宜條件(見表1)和使用注意事項(見表2)。池塘使用前需用殺菌劑對全池和使用器皿進行徹底消毒，暴曬晾干后再注入清潔的水。使用水質(zhì)調(diào)節(jié)劑后不得使用殺菌劑，也不可以與抗生素或農(nóng)藥合用。因不同類型的菌群對水體pH值要求不同，pH值會影響藥物發(fā)揮作用的速度，所以應根據(jù)實際情況對水體酸堿度進行調(diào)節(jié)。使用后也應加大監(jiān)管力度，防止水體缺氧造成不必要的損失，也可適當?shù)厝斯す┭?。應根?jù)蝌蚪生長規(guī)律和產(chǎn)生廢物的進程來定時、定量、規(guī)律地使用水質(zhì)調(diào)節(jié)劑，防止因用量過大、耗氧量過大所產(chǎn)生的不良反應事件發(fā)生。儲存時注意避光、密閉、冷藏保存，但部分調(diào)節(jié)劑貯藏期過短，過期后雖降解功能降低但仍可使用，投入前可適當加量，避免不必要的浪費。同時，應注意及時去除魚、水蜈蚣、蜻蜓幼蟲、青蛙等有害生物。

表1 各類水質(zhì)調(diào)節(jié)劑最佳使用時期及適用范圍

表2 各類水質(zhì)調(diào)節(jié)劑特點及使用注意事項

2.9 放養(yǎng)期監(jiān)護

由于目前林蛙尚采用半人工馴養(yǎng)的方式，因此每年6月中旬開始，幼蛙將陸續(xù)上山放養(yǎng)，此時需定時在岸邊平坦處放置嫩青草、石磚瓦塊等遮擋物。同時，根據(jù)氣候的干燥程度定期灑水；也可人為將幼蛙移至生長環(huán)境較好的河道內(nèi)自行疏散。根據(jù)環(huán)境中昆蟲的數(shù)量，可在放養(yǎng)區(qū)四周添加黃粉蟲等活體飼料。林蛙的放養(yǎng)密度一般為當年幼蛙3000～5000只/hm2有效森林，2年以上生幼蛙3000只/hm2有效森林；蛙群中1年生幼蛙與2～3年生成蛙比例為7∶3左右。放養(yǎng)期間應避免牲畜、家禽及人員進入放養(yǎng)區(qū)域。

2.10 回捕與采收

每年10月中旬(霜降前后)，林蛙自然開始下山進入河流，雨后集群回河?；夭兑话阍诹滞芑睾雍筮M行，或在越冬池整體捕撈。經(jīng)過約2年生長期(從第一年4月份的蝌蚪生長到第二年的10月份入冬前)，體質(zhì)量約25 g以上的為成蛙。采收與留種同時進行，先留下足夠的種蛙，剩余為商品蛙。未達到成蛙限定的，可放回貯蛙池或越冬池繼續(xù)飼養(yǎng)。

哈蟆油藥材應裝入密封袋或玻璃盒中密閉儲藏，防止吸潮變霉，必須冷凍保存。每個外包裝應有標簽以便識別。標明產(chǎn)地、質(zhì)量、等級、生產(chǎn)者或經(jīng)營者名稱、地址、聯(lián)系電話等。運輸過程中嚴格密閉保存，同時禁止與有害、有毒或其他可造成污染物品混貯、混運，嚴防返潮現(xiàn)象發(fā)生。

2.11 越冬管理

回捕的未達到成蛙限定的林蛙可以先放回貯蛙池暫存(池水深度80～100 cm)，其密度為500～800只/m2，貯存時間為9月下旬—11月中旬。貯蛙時，池底應設置隱蔽物(如塑料薄膜等)，池內(nèi)水應3 d更新1次。11月中旬前需移入越冬池(池水深度為1.5～2.0 m)，成蛙密度50～60只/m2，幼蛙密度可適當增加，一般100～300只/m2(蛙應依大小分開，不宜在同一池子里越冬)。若在室內(nèi)越冬，室溫保持在-10～5 ℃，水溫在2 ℃左右，不凍層1 m，密度在800只/m2，保持水體流動。此外，也可采用天然條件越冬，即利用養(yǎng)殖場中的河道或池塘，林蛙在河道緩流段的深水灣、樹根下、石縫里、泥沙中均可越冬；對缺少隱蔽物的河道，可通過放置草捆、樹枝、石塊等為隱蔽物，但注意應不阻塞河道，保持河道內(nèi)水體流動，防止形成延冰；或者是在此基礎上，人工修建小的塘壩來越冬。越冬期管理要注意保證越冬池水的溶氧量在6 mg·L-1，并清除雜魚、雜草、淤泥，防止有機物過剩而增加氧氣消耗。林蛙正常越冬的病死率在2%～10%。

3 小結(jié)與討論

3.1 林蛙品種問題

由于中國林蛙存在4個亞種，且在東北地區(qū)尚有黑龍江林蛙R.amurensisBoulenger、桓仁林蛙R.huanrenensisLiu等多個品種分布[2]。因此，對于林蛙馴養(yǎng)品種的確定十分必要。雖已有研究采用DNA條形碼技術(shù)對哈蟆油基原動物進行鑒別[9]，但因目前對中國林蛙的分類有分歧，使得林蛙的藥用品種有待確認。建議采用DArT多樣性芯片技術(shù)標記或SSR微衛(wèi)星分子標記，以及膜基因芯片等技術(shù)[10-12]，對人工馴養(yǎng)林蛙的遺傳系譜進行確認，進而進行優(yōu)良品種的繁育，解決林蛙的品種來源問題。

3.2 放養(yǎng)期監(jiān)控問題

由于夏季林蛙在深林中放養(yǎng)處于無監(jiān)護、無保護狀態(tài)，對于林蛙種群的數(shù)量、密度、遷徙分布范圍、生活質(zhì)量、病蟲害預警、敵害侵襲等均無有效的監(jiān)控措施，無法保證林蛙種群遺傳與數(shù)量的穩(wěn)定性，嚴重制約了林蛙養(yǎng)殖規(guī)模化、規(guī)范化、集約化發(fā)展。建議引進電子標識技術(shù)[13-14]，通過對放養(yǎng)期林蛙種群的生長習性、生境特點、病蟲害、物種侵襲等實時監(jiān)控，發(fā)現(xiàn)更適于林蛙生長的環(huán)境條件，為真正實現(xiàn)林蛙的人工養(yǎng)殖提供依據(jù)。

3.3 林蛙產(chǎn)業(yè)鏈發(fā)展問題

林蛙作為哈蟆油的基原動物具有悠久的歷史，被譽為“關東三寶”之一及“水陸八珍”之首[4]。但由于目前林蛙產(chǎn)業(yè)鏈尚不完善，難以滿足養(yǎng)殖業(yè)對效益的需求。如何提高林蛙養(yǎng)殖企業(yè)對其產(chǎn)品開發(fā)的參與度，滿足市場對哈蟆油及林蛙制品的需求，是亟待解決的關鍵問題。建議將“產(chǎn)、研、銷”結(jié)合起來，這樣既可從源頭上解決養(yǎng)殖中的一系列問題，也可從終端的信息反饋中得到啟發(fā)，從而解決林蛙及哈蟆油開發(fā)上的產(chǎn)品升級換代、附加值提升等問題，進而使終端的銷售更具有競爭力。