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        不同產(chǎn)地蟾酥藥材HPLC指紋圖譜及模式識別研究△

        2019-09-17 11:17:32成小蘭龐中化王志剛胡春萍呂章明曹鵬
        中國現(xiàn)代中藥 2019年9期
        關(guān)鍵詞:蟾酥蟾蜍產(chǎn)地

        成小蘭,龐中化,王志剛,胡春萍,呂章明,曹鵬

        江蘇省中醫(yī)藥研究院/南京中醫(yī)藥大學(xué) 附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,江蘇 南京 210028

        蟾酥為蟾蜍科動物中華蟾蜍BufobufogargarizansCantor或黑眶蟾蜍BufomelanostictusSchneider耳后腺和皮膚腺干燥分泌物,主產(chǎn)于河北、山東、四川等地。蟾酥味甘、辛,性溫,有毒,具有開竅醒神、解毒、止痛等功效,主治惡瘡、瘰疬、癌腫、咽喉腫痛、牙痛等局部結(jié)腫及其引發(fā)的疼痛[1]。近年被用于治療急性心力衰竭、慢性支氣管炎、坐骨神經(jīng)痛等[1-2]?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,蟾酥具有抗腫瘤、強心、局部麻醉、鎮(zhèn)痛、抗炎等多種作用[3]。最新研究顯示,蟾酥可增強去甲腎上腺素所引起的大鼠輸精管的收縮,并呈劑量依賴性收縮反應(yīng)。此外,蟾酥還具有鎮(zhèn)咳、利尿、興奮腸道平滑肌以及促進糖元抑制乳酸生成的胰島素樣作用[4]。蟾酥含有大量蟾蜍毒素類物質(zhì),尚含有酯蟾毒配基-3-單辛二酸脂、蟾毒靈-3-單辛二酸酯、華蟾毒精-3-單辛二酸酯、膽固醇、吲哚系堿類等成分,其中蟾蜍毒素類成分是蟾酥的主要有效成分[5-7]。蟾酥是臨床常用的名貴動物藥之一,應(yīng)用廣泛,療效確切。眾多成方制劑如六神丸、麝香保心丸、蟾酥注射液等均含有該藥材。由于蟾蜍基原動物的多樣化,加之中藥大品種的技術(shù)升級以及蟾酥資源需求量的增加,蟾酥價格不斷高漲,不法商販在蟾酥中摻假以謀取暴利,導(dǎo)致市場商品蟾酥品種混雜、摻雜、摻假現(xiàn)象嚴(yán)重,常見摻偽品主要包括:淀粉、泥沙、蛋白、松香粉、牙膏、肥皂、豬油等雜質(zhì)[8]?;靷纹穼?dǎo)致蟾酥質(zhì)量差異較大,不能保證用藥的有效性和安全性。因此建立有效可靠的蟾酥藥材鑒定方法,用于嚴(yán)格控制蟾酥藥材及飲片的質(zhì)量顯得尤為重要。

        蟾酥常用的傳統(tǒng)真?zhèn)舞b別方法包括外觀形狀鑒別和理化鑒別。但由于蟾酥經(jīng)過初加工后,缺乏基原動物的外觀形態(tài),傳統(tǒng)鑒別法存在一定的局限性。近年來,隨著DNA分子鑒定技術(shù)的發(fā)展,基于COI基因條形碼技術(shù)的藥材分子鑒定為動物藥材的鑒別提供了全新而有效的輔助手段[9]。但由于蟾蜍是兩棲類動物,且該兩棲類物種基因組受環(huán)境影響較大,基因組存在較大的變異性,單純依靠COI測序難以對蟾蜍進行鑒定。此外,在蟾酥加工過程中,DNA受到較大破壞,因此難以從蟾酥中提取線粒體DNA,更增加了通過條形碼鑒定混偽品的難度。中藥色譜指紋圖譜是一種綜合的、整體的鑒定手段,可較全面地反映藥材/飲片的化學(xué)成分以及特征峰面積的相對比例。在對藥材/飲片指紋圖譜分析的基礎(chǔ)上,采用不同的統(tǒng)計處理方法進行化學(xué)模式識別,可在藥材/飲片質(zhì)量、產(chǎn)地、種屬、真?zhèn)蔚呐袆e中克服人工鑒定的主觀因素,從而更加準(zhǔn)確地對藥材進行真?zhèn)舞b別和質(zhì)量評價,應(yīng)用廣泛[10-11]。本研究采用HPLC梯度洗脫法構(gòu)建不同產(chǎn)地蟾酥藥材指紋圖譜,并對10批樣品進行相似度評價、聚類分析和主成分分析,旨在為蟾酥的質(zhì)量控制和鑒別研究提供科學(xué)依據(jù)。

        1 儀器與材料

        1.1 儀器

        Waters 2695高效液相色譜系統(tǒng),Waters2996型二極管陣列檢測器,Empower色譜工作站(美國Waters公司),METTLER AB204-S萬分之一電子天平,METTLER AG285十萬分之一電子天平,Milli-Q純水器(美國Millipore公司)

        1.2 試劑

        甲醇、乙腈為色譜純(美國TEDIA公司);水為超純水;其他試劑為分析純。

        1.3 對照品

        蟾毒它靈、蟾毒靈以及華蟾毒精對照品由江蘇省中醫(yī)藥研究院化學(xué)研究室提供,純度>98%。

        1.4 實驗樣品采集及鑒定

        本研究所用蟾酥樣品詳見表1。所有樣品均由江蘇省中藥研究院中藥資源實驗室錢士輝研究員鑒定。

        表1 蟾酥樣品信息

        2 實驗方法

        2.1 色譜條件

        利用高效液相色譜法,采用Waters MS C18色譜柱(250 mm×4.6mm,5 μm);流動相:純水和0.1% TFA乙腈溶液(梯度洗脫);檢測波長:296 nm;柱溫:30 ℃;流速:1.0 mL·min-1,進樣體積30 μL。

        表2 純水(A)-0.1% TFA乙腈(B)梯度洗脫

        2.2 對照品溶液的制備

        精密稱取蟾毒它靈、蟾毒靈以及華蟾毒精對照品適量,分別用甲醇溶解得對照品溶液。精密吸取各對照品溶液1 mL,置10 mL量瓶中,甲醇稀釋至刻度,搖勻,作為混合對照品溶液。

        2.3 供試品溶液的制備

        稱取蟾酥細(xì)粉約0.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加入50 mL甲醇稱質(zhì)量,加熱回流提取1 h,放冷,加甲醇補足損失質(zhì)量,搖勻,靜置,上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過,續(xù)濾液作為供試品溶液。

        3 實驗結(jié)果

        3.1 方法學(xué)驗證

        3.1.1 精密度試驗 取蟾酥供試品溶液(S1),按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣6次,采用《中藥色譜特征圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)》分析,以蟾毒靈為參照物,各共有峰相對保留時間RSD為0.096 0%~0.156 9%,相對峰面積RSD為0.840 6%~3.349 3%,均小于5%,符合指紋圖譜檢測要求。

        3.1.2 穩(wěn)定性試驗 取蟾酥供試品溶液(S1)分別在0、2、4、12、24 h進行HPLC檢測,以蟾毒靈為參照物,各共有峰的相對保留時間RSD值為0.263 6%~0.521 2%,相對峰面積RSD為2.414 0%~3.666 3%,表明供試液24 h內(nèi)穩(wěn)定。

        3.1.3 重復(fù)性試驗 取同一份蟾酥樣品(S1)6份,按2.3項下方法制備樣品溶液,按2.1項下色譜條件進樣,采用《中藥色譜特征圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)》分析,以蟾毒靈為參照物,各共有峰相對保留時間RSD為0.063 9%~0.439 0%,相對峰面積RSD為0.659 2%~4.952 0%,表明重復(fù)性良好。

        3.2 不同產(chǎn)地蟾酥指紋圖譜的建立與分析

        3.2.1 HPLC指紋圖譜測定 取不同產(chǎn)地10批蟾酥樣品,按2.3項下方法制備供試品溶液,按2.1項下色譜條件測定,記錄色譜圖,結(jié)果見圖1。

        圖1 蟾酥HPLC特征圖(S1~S10)

        3.2.2 對照指紋圖譜的建立和共有峰的標(biāo)定 將3.2.1條件下測定的色譜圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入相似度評價系統(tǒng)軟件,以S1樣品為參考圖譜,時間窗寬度設(shè)為0.1 s,中位數(shù)法生成對照指紋圖譜(圖2)。蟾酥色譜指紋圖譜以保留時間為44.079 6 min的9號峰作為參照峰S,對不同蟾酥藥材的指紋圖譜進行考察,共確定了10個共有峰,各共有峰面積見表3。

        圖2 蟾酥對照指紋圖譜

        表3 不同產(chǎn)地10批蟾酥藥材共有峰面積

        3.2.3 指紋圖譜分析 由圖1可知,蟾酥化學(xué)成分復(fù)雜,不同產(chǎn)地蟾酥化學(xué)組成基本相似,但含量差別較大,其共有峰面積RSD為4.22%~17.31%,在10 批次樣品圖中9號色譜峰(蟾毒靈)的分離度良好,所有樣品共有且為蟾酥主要成分之一,因此將其確定為參照峰S。

        3.2.4 相似度評價 使用《中藥色譜特征圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件(2012版)》對10批蟾酥藥材色譜數(shù)據(jù)進行分析,以S1樣品色譜圖譜作為參照圖譜,采用“中位數(shù)”法生成對照圖譜,得到10批蟾酥藥材特征圖譜及相似度。結(jié)果10批不同產(chǎn)地蟾酥藥材各色譜圖相似度在0.920~0.967,表明10批藥材相似度較好。

        表4 不同產(chǎn)地蟾酥HPLC指紋圖譜相似度計算結(jié)果

        3.3 主成分分析

        以蟾酥指紋圖譜中標(biāo)定的共有峰相對峰面積為變量,用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件的因子分析進行主成分分析,以主成分的特征根及貢獻率作為選擇主成分的依據(jù)。主成分個數(shù)提取原則是取主成分對應(yīng)的特征值大于1的前2個主成分,其累計貢獻可以達(dá)到87.558%,即包括了大部分信息。其中第一主成分特征值為5.977,方差貢獻率為59.769%;第二個主成分特征值為2.779,方差貢獻率為27.789%。分別以第一、第二主成分來建立坐標(biāo)系,得到所有樣本PCA二維投影圖(圖4),圖中每一個點對應(yīng)一個產(chǎn)地,10個產(chǎn)地可分為3類。

        圖3不同產(chǎn)地蟾酥藥材PCA圖

        3.4 共有蜂的確認(rèn)

        本研究對10批蟾酥供試品溶液進行指紋圖譜檢測,確定了10個共有峰,并通過與對照品溶液比對,指認(rèn)了其中3個色譜峰,分別為7號(蟾毒它靈)、9號(蟾毒靈)、10號(華蟾毒精)。結(jié)果見圖4。

        注:A.對照品;B.蟾酥樣品;7.蟾毒它靈;9.蟾毒靈;10.華蟾毒精。圖4 對照品和蟾酥樣品HPLC圖

        4 結(jié)論

        蟾酥為蟾蜍科動物中華蟾蜍BufobufogargarizansCantor或黑眶蟾蜍BufomelanostictusSchneider耳后腺和皮膚腺干燥分泌物。我國分布的蟾蜍科蟾蜍屬動物品種眾多,達(dá)十余種之多。分布最廣的是中華大蟾蜍、花背蟾蜍BuforaddeiStrauch、黑眶蟾蜍和華西蟾蜍BufobufoAndrewsi。有研究表明,不同基原動物蟾酥成分差異顯著。不同品種蟾蜍地理上交叉分布,加上捕捉者缺乏動物品種的準(zhǔn)確辨識,易導(dǎo)致蟾酥品種混雜現(xiàn)象以及蟾酥藥材質(zhì)量的參差不齊,從而嚴(yán)重影響藥材療效及安全性,增加臨床用藥的安全風(fēng)險。

        本研究收集了10批不同產(chǎn)地的蟾酥藥材,優(yōu)化色譜條件,建立了蟾酥的HPLC指紋圖譜。在10個共有峰中,有3個色譜峰經(jīng)與對照品溶液比對,分別指認(rèn)為蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾毒精。使用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)分析不同批次蟾酥樣品的相似度為0.920~0.967,表明10批藥材相似度較高。利用PCA方法對蟾酥藥材的HPLC指紋圖譜進行分析。聚類分析結(jié)果表明,10批樣品可分成3類,樣品S1、S2、S6、S7、S8、S10聚為一類,樣品S3、S9聚為一類,樣品S4、S5聚為一類,與相似度結(jié)果一致。

        本研究建立了蟾酥的HPLC指紋圖譜,共確定了10個共有蜂。中藥指紋圖譜可以全面反映蟾酥藥材的化學(xué)成分以及各特征性有效成分間峰面積的相對比例,進而反映蟾酥藥材的內(nèi)在質(zhì)量,為蟾酥藥材判斷真?zhèn)?、評價優(yōu)劣、考察穩(wěn)定性和一致性提供依據(jù)。本實驗采用指紋圖譜結(jié)合PCA對不同產(chǎn)地蟾酥進行質(zhì)量評價,所建立的測定方法快速準(zhǔn)確,靈敏度高,可為蟾酥藥材的質(zhì)量控制和質(zhì)量鑒別提供有效手段。

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