王芳，范雨，葉茂，曹秀君，童芯鋅，彭成，國(guó)錦琳

成都中醫(yī)藥大學(xué) 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137

阿膠(Asini Corii Colla)為馬科動(dòng)物驢EquusasinusL.的干燥皮或鮮皮經(jīng)煎煮和濃縮制成的固體膠，具有優(yōu)良的滋補(bǔ)作用?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》(以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》)明確規(guī)定生產(chǎn)阿膠的原料是驢皮[1]。由于阿膠在市場(chǎng)上經(jīng)常供不應(yīng)求，以其他動(dòng)物皮加工成偽阿膠的現(xiàn)象層出不窮，主要以廉價(jià)的豬皮、牛皮作為皮源，甚至用重金屬超標(biāo)的廢舊皮革制成的明膠摻假，服用后有明顯不良反應(yīng)，因此亟需建立阿膠質(zhì)量控制方法。

不同皮源膠原蛋白同源性高，氨基酸組成及含量極為相近，具有相似的化學(xué)性質(zhì)，常用方法如：氨基酸組分含量分析、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE)法及色譜法等均缺乏專屬性、針對(duì)性，難以對(duì)不同皮源膠原蛋白進(jìn)行有效鑒別[2]。阿膠在加工過程中脫氧核糖核酸(DNA)降解破壞嚴(yán)重，因此DNA分子鑒定方法難以有效鑒別阿膠[3]。近年來(lái)，雙向凝膠電泳技術(shù)(2-DE)與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)識(shí)別特征多肽逐漸成為膠類中藥材鑒定的主流方法[2]。Aina等[4]采用2-DE技術(shù)初步檢測(cè)出10個(gè)豬皮膠特異蛋白斑點(diǎn)，2-DE技術(shù)對(duì)蛋白制備要求高，條件考察繁瑣。而LC-MS技術(shù)由于其快速、精準(zhǔn)及全面分離分析的特點(diǎn)，已廣泛用于蛋白組學(xué)研究，成為對(duì)多肽組分、結(jié)構(gòu)及殘基修飾進(jìn)行分析的主流技術(shù)[5]。2009年，Zhang等[6]利用胰酶酶解豬和牛明膠，通過LC-MS檢測(cè)出可區(qū)分豬和牛明膠的特征肽并給出氨基酸序列，建立了LC-MS技術(shù)識(shí)別特征肽鑒別豬牛明膠的新方法。2012年，Cheng等[7]通過超高壓液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(UPLC-QTOF)首次系統(tǒng)性檢測(cè)5種皮膠原(驢皮膠、豬皮膠、牛皮膠、龜殼膠及鹿角膠)特征肽對(duì)5類皮膠原進(jìn)行專屬性鑒別，但比對(duì)特征肽序列發(fā)現(xiàn)牛皮膠特征肽序列與驢皮膠并無(wú)差異，可能是樣品前處理導(dǎo)致結(jié)果不太理想?！吨袊?guó)藥典》中采用LC-MS法，以質(zhì)荷比(m/z)539.8離子對(duì)阿膠進(jìn)行鑒定，但未給特征肽序列[1]，特異性不能最終確定，但仍能表明LC-MS技術(shù)已用于建立膠類藥材質(zhì)量控制規(guī)范。2015年，Chen等[8]采用超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法建立了特異快速檢測(cè)中成藥鹿角膠中摻偽驢皮和牛皮成分專屬性特征離子峰方法，但未確定特征肽序列。綜上所述，當(dāng)前鑒定方法存在一些共有的局限：1)皮膠原成分復(fù)雜，除了主要成分膠原蛋白外，還含有血清蛋白、毛發(fā)等雜質(zhì)，這些雜質(zhì)會(huì)干擾以膠原蛋白為對(duì)象的鑒定方法，另外，膠原蛋白分子量大、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定及難溶等特點(diǎn)也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性，但此環(huán)節(jié)常被忽略；2)基于酶解后基質(zhì)的復(fù)雜性，直接從總離子流圖(TIC)中尋找特征性肽段，針對(duì)性不強(qiáng)，效率不高；3)找出了特征離子，還需進(jìn)一步的鑒定特征肽序列以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性，繁瑣耗時(shí)。

因此，本研究首次通過生物信息技術(shù)模擬酶解過程以全面準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)驢皮、豬皮及牛皮的特征肽并獲得相應(yīng)的序列及分子量信息，對(duì)樣品前處理和酶解條件進(jìn)行全面考察優(yōu)化，獲得穩(wěn)定、大量、連續(xù)的小分子肽段，采用UPLC/Q-TOF-MS進(jìn)行高效分離分析，驗(yàn)證理論篩選出的特征肽段，從而建立穩(wěn)定、靈敏、可量化及專屬性高的阿膠鑒定和質(zhì)量控制方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 隨機(jī)收集不同企業(yè)不同批號(hào)的阿膠以及不同市場(chǎng)銷售的驢皮、牛皮和豬皮樣品，樣品信息見表1，均經(jīng)過成都中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)錦琳教授鑒定，留樣保存于成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

表1 樣品信息

1.1.2 試劑 牛血清蛋白(BSA)、丙烯酰胺、甘氨酸、Tris堿、N，N′-甲叉丙烯酰胺、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺、N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基硫酸鈉(SDS)均購(gòu)自Bio-Rad公司；考馬斯亮藍(lán)R-250與G-250、過硫酸銨(APS)、β-巰基乙醇和溴酚藍(lán)指示劑均購(gòu)自鵬程生物科技有限公司；極低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker、低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker購(gòu)自北京Solarbio；胰蛋白酶Trypsin 1：250(CAS：9002-07-7，Amersco)。

乙腈、甲醇為色譜純，均購(gòu)自Thermofisher公司；碳酸氫銨、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸、三氯甲烷、環(huán)己烷、二氯甲烷、乙醇、丙酮、冰乙酸、甲酸、丙三醇和三氯乙酸均為分析純，購(gòu)自成都科龍化工試劑廠。

1.1.3 儀器 肽柱-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，2.7 μm，Agilent)；L-8900型全自動(dòng)氨基酸分析儀(日立高新技術(shù)公司)；UMAX PowerLook 2100XL凝膠掃描成像系統(tǒng)(Bio-Rad)；MINI-PROTEAN 165-8000小型垂直電泳儀(Bio-Rad)；DHG-9035A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海島韓實(shí)業(yè)公司)；BP211D 型十萬(wàn)分之一分析天平(德國(guó)Sartorius)；UV-1800 PC型紫外分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)；Agilent 1200SL-6210A高效液相串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Agilent)；DP-D501普通型冷凍干燥機(jī)(無(wú)錫德普儀器制造有限公司)。KQ5200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；FE-20K型pH計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)；電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；Allegra TM X-22R型低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter)。

1.2 生物信息技術(shù)模擬酶解

通過查詢National Center for Biotechnology Information蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI)，采用生物信息學(xué)軟件ExPaSy PeptideCutter模擬酶解尋找酶切位點(diǎn)，比對(duì)驢皮、牛皮和豬皮的I型膠原蛋白α1鏈氨基酸序列，找出其差異。再利用軟件ExPASy PeptideMass模擬胰酶酶解結(jié)果，篩查驢皮特異性肽段[9]。

1.3 樣品處理

所有皮部樣品均按照《中國(guó)藥典》方法進(jìn)行處理，具體做法是：先取一定量的樣品，浸泡于水中并除毛切塊，再次洗凈后水煮過濾，將過濾液濃縮至濃稠糊狀，最后冷卻使其凝固，切成片并干燥，制成堅(jiān)固的膠狀，打粉過六號(hào)藥典篩后4 ℃保存。

本研究摸索超聲法、加熱法及碾磨法對(duì)樣品進(jìn)行溶解處理。稱取1 g樣品粉末，加入40 mL 1% NH4HCO3溶液置于50 mL錐形瓶中，密封后用超聲處理20 min；密封后放入水浴鍋中以60 ℃加熱30 min溶解后取出樣品溶液；稱取1 g阿膠樣品粉末于研缽中碾磨，加入40 mL1% NH4HCO3溶液研磨至溶解；將3種方法處理后的溶解樣品分別按8000 r·min-1離心20 min，Bradford法[10]測(cè)定蛋白含量。采用環(huán)己烷-三氯甲烷和環(huán)己烷-二氯甲烷萃取系統(tǒng)對(duì)樣品進(jìn)行處理[11-12]。再通過三氯乙酸-丙酮法、過濾法和超濾法進(jìn)行純化[13]。在參考方法上稍有改動(dòng)：過濾法，將溶解后的樣品用0.45 μm微孔濾膜過濾除菌，置4 ℃保存待用；超濾法，將萃取后的樣品置于10 kDa的超濾管中3000 r·min-1離心30 min后將小分子雜質(zhì)除去。通過SDS-PAGE電泳法對(duì)樣品處理效果進(jìn)行評(píng)定，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，上樣量為20 μL，其余蛋白樣品-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 生物酶解

將上述蛋白樣品進(jìn)行胰酶酶解(1% NH4HCO3配制成1 mg·mL-1胰酶溶液，酶活250 U·mg-1)。為保證樣品中膠原蛋白被完全酶解為小肽，本研究從酶解的時(shí)間、溫度、酶量、pH值4個(gè)方面進(jìn)行考察條件[9]，設(shè)置如表2所示。

將酶解液放入超濾管中3000 r·min-1離心50 min，收集濾液，三羥甲基甲基甘氨酸-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Tricine-SDS-PAGE)進(jìn)行分析[9]。

表2 酶解條件

1.5 UPLC/Q-TOF-MS分析

色譜柱為Agilent肽柱-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，2.7 μm)；選用0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相A，選用乙腈作為流動(dòng)相B。梯度0～5 min，5%B；5～8 min，5%～10%B；8～32 min，10%～20%B；32～38 min，20%～95%B；38～38.1 min，95%～5%B；流速0.30 mL·min-1；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量1.0 μL。

氮?dú)饬髁繛?0 L·min-1，毛細(xì)管電壓為4.0 kV，噴霧壓力為40 Psi，碎裂電壓設(shè)為150 V，霧化氣溫度350 ℃，在正離子模式下檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 I型膠原蛋白模擬酶切的生物信息分析

I型膠原蛋白α1鏈氨基酸序列在NCBI、Swiss-prot上查得，其序列號(hào)為：豬皮Ovisaries(XP_013836466)、驢皮Equusasinus(GI：221665286)、牛皮Bostaurus(GI：77404252)。通過DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行同源比對(duì)，上述序列相似性95.56%?？梢钥闯?，不同種類的動(dòng)物皮，盡管I型膠原蛋白α1鏈序列非常相似，但是所查到的3種皮類的氨基酸序列存在差異，這為后續(xù)試驗(yàn)提供了理論基礎(chǔ)。除此之外，序列的比對(duì)結(jié)果表明，4種膠原蛋白特異氨基酸(羥脯氨酸、脯氨酸、甘氨酸和丙氨酸)的組成與含量沒有顯著差別，這提示了傳統(tǒng)區(qū)分阿膠的真?zhèn)蔚姆椒ㄊ蔷哂胁蛔阒幍摹?/p>

據(jù)Peptide Cutter生物信息學(xué)軟件模擬酶解過程，顯示出膠原蛋白能被胰酶酶解為相對(duì)較多的小分子片段，因此選擇胰酶酶切。然后經(jīng)過軟件系統(tǒng)ExPASy PeptideMass模擬酶切得到的肽段序列，與后續(xù)特異性肽片段互相印證。表3顯示的是通過3種皮類I型膠原蛋白α1鏈模擬酶切結(jié)果，酶解肽段分子量在0.6～2.5 kDa范圍內(nèi)，對(duì)比篩選出13個(gè)牛皮、12個(gè)驢皮及12個(gè)豬皮源特異肽段，酶解肽段具有較高的連續(xù)性和匹配度，為質(zhì)譜識(shí)別特征多肽提供基礎(chǔ)，也為后期實(shí)驗(yàn)奠定理論依據(jù)。

表3 生物信息分析篩選的牛皮、驢皮、豬皮I型膠原蛋白α1鏈特征肽段信息

2.2 驢皮及其他皮類總離子流圖的建立

2.2.1 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化 阿膠含雜質(zhì)多，主要成分為膠原蛋白，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，難溶。本實(shí)驗(yàn)比較了超聲法、加熱法及研磨法溶解樣品，結(jié)果表明：加熱法比超聲法溫和，提取的蛋白量大，蛋白損傷量小。二氯甲烷-環(huán)己烷萃取系統(tǒng)和超濾法純化后的樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳(見圖1)?？梢钥闯?，蛋白分子量在180～300 kDa，符合膠原蛋白分子量分布范圍?；谝陨蠑?shù)據(jù)，本研究采用加熱法溶解、二氯甲烷-環(huán)己烷萃取和超濾法對(duì)樣品進(jìn)行前處理。

注：A.萃取系統(tǒng)考察；B.純化條件考察；1.三氯甲烷-環(huán)己烷萃取系統(tǒng)；M.蛋白Marker；2.二氯甲烷-環(huán)己烷萃取系統(tǒng)；3.過濾法；4.超濾法；5.三氯乙酸-丙酮法。圖1 不同前處理?xiàng)l件阿膠的SDS-PAGE電泳圖譜

2.2.2 酶解條件優(yōu)化 通過Tricine-SDS-PAGE檢測(cè)酶解結(jié)果，優(yōu)化后的酶解條件為：酶解溫度38 ℃，消化時(shí)間12 h以上，pH 8.0，加酶比為4∶1～1∶1，底物質(zhì)量濃度為0.017～0.025 g·mL-1。以上條件下，膠原蛋白被較為充分酶解，酶解肽段多集中在1.2～3.3 kDa，與生物信息預(yù)測(cè)結(jié)果基本相符，圖2為底物濃度考察結(jié)果。

注：1.加酶比為1∶1；2.加酶比為2∶1；M.蛋白Marker；3.加酶比為3∶1；4.加酶比為4∶1。圖2 底物濃度考察Tricine-SDS-PAGE電泳圖譜

2.2.3 3種皮類UPLC-TOF/MS分析結(jié)果 由圖3可見，3種皮類的多肽總離子流圖較為相似，主要是由于特征性肽段的數(shù)量在膠原蛋白序列中所占比例小。根據(jù)《中國(guó)藥典》方法提供的阿膠特征性多肽離子m/z 539.8，對(duì)3種皮類的圖譜進(jìn)行提取離子分析。

注：Sample 1.牛皮樣品多肽總離子流圖；Sample 2.豬皮樣品多肽總離子流圖；Sample 3.驢皮樣品多肽總離子流圖。圖3 3種皮類所得多肽的液質(zhì)聯(lián)用總離子流圖

經(jīng)驗(yàn)證，m/z539.8對(duì)樣品進(jìn)行提取離子分析，能找出3種皮類的差異，酶解驢皮在16.87 min提取離子掃描中有明顯響應(yīng)值。而其他皮類是空白，由此可根據(jù)m/z539.8來(lái)鑒定阿膠真?zhèn)?，?jīng)換算，藥典用于鑒定阿膠的特征肽段不包含在生物信息技術(shù)預(yù)測(cè)的驢皮特征肽段內(nèi)，推測(cè)可能由于樣品前處理及酶解條件差異產(chǎn)生不完全酶解或與肽段上某些氨基酸殘基后期修飾有關(guān)。

將理論計(jì)算出的特異性肽段分子量換算為m/z，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果顯示，m/z766.4能找出3種皮類的差異，酶解驢皮在27.76 min提取離子掃描中有明顯響應(yīng)值，表明m/z為766.4，分子量為1 530.802 2可作為鑒別阿膠的特異峰，對(duì)應(yīng)的多肽為GEAGPAGPAGPIGPVGAR。

2.3 實(shí)際樣品的鑒定結(jié)果

對(duì)于10組收集到的樣品用上述的特異性阿膠鑒別方法能進(jìn)行有效的鑒別。數(shù)據(jù)結(jié)果表明(圖4)，10組阿膠樣品中，僅3、4、10號(hào)阿膠樣品檢測(cè)出特征峰，以驢皮膠為對(duì)照，測(cè)定特征峰相對(duì)豐度，結(jié)果顯示這3種阿膠樣品相對(duì)豐度分別為67%、38%、72%，因此，這3種阿膠產(chǎn)品基本符合標(biāo)準(zhǔn)，通過特征峰豐度分析可進(jìn)一步量化阿膠產(chǎn)品中驢皮膠含量。第7、9號(hào)樣品也出現(xiàn)特征峰，但相對(duì)豐度比例甚小，其余5種阿膠樣品完全檢測(cè)不出特征峰，可由此結(jié)果推測(cè)阿膠質(zhì)量問題之嚴(yán)重。

注：A.3號(hào)阿膠樣品的提取離子流圖；B.4號(hào)阿膠樣品的提取離子流圖；C.10號(hào)阿膠樣品的提取離子流圖。圖4 酶解阿膠樣品m/z 766.4時(shí)提取離子流圖

3 結(jié)論與展望

驢、牛及豬的膠原蛋白氨基酸序列在NCBI上查得后經(jīng)ExPASy PeptideMass進(jìn)行酶切模擬，得到12段驢皮存在的特異性肽段，可能為特異性鑒別肽段。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，m/z766.4，分子量為1 530.802 2，對(duì)應(yīng)的多肽為GEAGPAGPAGPIGPVGAR能有效鑒別驢皮與其他皮類。在10組阿膠樣品中，據(jù)此肽段進(jìn)行鑒定的結(jié)果表明該方法與《中國(guó)藥典》方法的鑒定能力一致。本實(shí)驗(yàn)首次運(yùn)用生物信息技術(shù)模擬、對(duì)比和篩選3種皮類胰酶酶解的差異性肽段，并提供肽段的氨基酸序列、位置及分子量。與已報(bào)道的特征肽段檢測(cè)方法相比，本研究采用生物信息技術(shù)結(jié)合HPLC-MS方法，通過理論實(shí)驗(yàn)相互印證使結(jié)果更加全面、穩(wěn)定、高效。另外，本研究首次對(duì)樣品前處理方法進(jìn)行系統(tǒng)考察，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定、高效奠定基礎(chǔ)。本研究基于生物信息技術(shù)結(jié)合UPLC/Q-TOF-MS技術(shù)，檢測(cè)到1條與預(yù)測(cè)結(jié)果匹配的驢皮膠特異肽，下一步將建立阿膠特異肽數(shù)據(jù)庫(kù)，促進(jìn)膠類藥材質(zhì)量控制方法的系統(tǒng)化和標(biāo)準(zhǔn)化。