徐楊 林飛躍 尹曉明

[摘要]目的 研究混合血小板裂解液（pHPL）對體外培養(yǎng)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMMSCs）原代培養(yǎng)、增殖和成骨分化的影響。方法 使用臨床過期的多份濃縮血小板混合，多次凍融激活后制備pHPL，分別使用胎牛血清（FBS）和pHPL加基礎(chǔ)培養(yǎng)液原代培養(yǎng)hBMMSCs，比較兩組中的細(xì)胞形態(tài)、表面標(biāo)志物、細(xì)胞骨架、細(xì)胞周期和增殖率，并在加入經(jīng)典成骨誘導(dǎo)液后檢測兩組中堿性磷酸酶含量、成骨相關(guān)基因含量和礦化結(jié)節(jié)形成，比較其成骨分化能力。結(jié)果 FBS和pHPL培養(yǎng)組均能較好地支持hBMMSCs的原代培養(yǎng)，兩組中細(xì)胞形態(tài)、表面標(biāo)志物、細(xì)胞骨架、細(xì)胞周期均無明顯差異，但pHPL組在5、7 d時的細(xì)胞增殖率明顯高于FBS組（P<0.05）;在成骨誘導(dǎo)后，pHPL組中堿性磷酸酶含量、成骨相關(guān)基因含量也明顯高于FBS組（P<0.05），兩組中細(xì)胞均可以形成成熟的礦化結(jié)節(jié)。結(jié)論 pHPL能夠很好支持hBMMSCs的原代培養(yǎng)、增殖和成骨分化，且較FBS能更好地促進(jìn)其增殖和成骨分化。

[關(guān)鍵詞]人血小板裂解液;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;原代培養(yǎng);增殖;成骨分化

[中圖分類號] R722.12? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）6（c）-0013-06

[Abstract] Objective To investigate the effect of pooled human platelet lysate in supporting human bone marrow mesenchymal stem cells for primary culture， propagation and osteogenic differentiation. Methods Multiple outdated platelet concentrates were pooled together. Then pHPL was made after repeated freeze/thaw cycles to activate the platelet. Either pHPL or FBS was used as medium supplement plus basic culture media for primary culture of human bone marrow mesenchymal stem cells. Cell morphology， surface marker expression， Cytoskeleton， growing circle， growth curve and osteogenic markers including ALP level， gene expression and formation of calcified nodules after induction with classic mineralized solution were compared between the two groups. Results There were no difference between the two groups in cell morphology， surface marker expression， cytoskeleton and growing circle. Cell growth rate in pHPL group was much higher than FBS group at 5 and 7 d （P<0.05）. Also ALP level and osteogenic markers gene expression in pHPL group were higher than FBS group （P<0.05）. Formation of mature calcified nodules was observed in both groups. Conclusion pHPL can support hBMMSCs for primary culture， propagation and osteogenic differentiation， and it is better to promote their propagation and osteogenic differentiation than FBS.

[Key words] Human platelet lysate; Bone marrow mesenchymal stem cells; Primary culture; Propagation; Osteogenic differentiation

組織工程和細(xì)胞治療應(yīng)用中，特定種子細(xì)胞在體外適宜條件下的培養(yǎng)、擴(kuò)增乃至誘導(dǎo)分化是其中非常關(guān)鍵的一個環(huán)節(jié)[1]。既往人體細(xì)胞的體外培養(yǎng)均有賴于添加了胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的培養(yǎng)基。雖然其能夠較好地支持細(xì)胞的生長和分化，但由于其含有異種蛋白，使得培養(yǎng)后的細(xì)胞回植人體可能存在難以預(yù)料的風(fēng)險，這也是實現(xiàn)臨床應(yīng)用的最大障礙之一[2]。尋找FBS的替代品，建立質(zhì)量穩(wěn)定可控的體外培養(yǎng)體系一直是研究的熱點。本研究使用混合異體血小板裂解液（pooled human platelet lysate，pHPL）代替FBS，研究其對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMMSCs）原代培養(yǎng)、增殖和分化的影響，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1 pHPL的制備

福建省血液中心采用富血小板血漿法制備的5袋濃縮血小板，超過儲存時間而不能用于臨床輸注。濃縮血小板于-30℃冷凍24 h，37℃解凍，混合解凍后的濃縮血小板，并分裝在50 ml離心管內(nèi)，重復(fù)凍融過程一次，獲得激活的pHPL，-30℃冷凍保存。使用時取分裝的pHPL解凍，4℃ 4000 r/min離心15 min，去除碎裂的細(xì)胞組織，吸取上清，按體積比10%加入DMEM-LG培養(yǎng)液中備用。本研究獲得福建省立醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，于2017年1月～2019年3月在福建省立醫(yī)院中心實驗室完成。

1.2 hBMMSCs的分離和培養(yǎng)

選取臨床上因為退變性疾病需要取髂骨植骨的患者，排除感染性和腫瘤性病變患者。術(shù)前獲得患者及家屬知情同意。術(shù)中抽取骨髓10～15 ml，通過密度梯度離心法分離hBMMSCs。細(xì)胞計數(shù)后，以1×107個/ml的密度等量接種于A組：10%FBS（PAN biotech，德國）+DMEM-LG培養(yǎng)液（Gibco，美國）和B組：10%pHPL+ DMEM-LG培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2、飽和濕度下進(jìn)行培養(yǎng)。24 h半量換液，48 h全量換液，以后每3天換液，待細(xì)胞生長至80%～90%時傳代，取第2～4代細(xì)胞實驗。

1.3方法

1.3.1倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

倒置顯微鏡逐日觀察兩組細(xì)胞的生長情況和形態(tài)特征。

1.3.2 hBMMSCs表面標(biāo)志物的檢測

兩組均取第3代細(xì)胞，0.25%胰酶消化采集細(xì)胞，PBS洗滌計數(shù)后重懸，密度3×106個/ml，取細(xì)胞懸液100 μl，加入鼠PE標(biāo)記的單克隆抗體CD29、CD44、CD105、CD14、CD90（eBlosdence，美國）各20 μl，并以鼠PE標(biāo)記的IgG1作為同型固定陰性對照，充分混勻，室溫避光半小時。上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，并用CellQuest軟件分析結(jié)果。

1.3.3細(xì)胞骨架免疫熒光染色

取第3代細(xì)胞，胰酶消化重懸后，以1×105個/ml的密度接種于12孔板，分別使用2種培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，吸棄舊培養(yǎng)液，用預(yù)溫PBS（37℃）清洗細(xì)胞。4%多聚甲醛室溫固定10 min，用0.1% Triton X-100/PBS室溫破膜5 min。5 μl FITC-Phalloidin（聯(lián)科生物，中國）貯存液加入150 μl PBS中配成工作液（5 μg/ml）并用以染色細(xì)胞，室溫染色60 min。PBS清洗后加熒光封片液封片，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞骨架系統(tǒng)，并用ImageJ軟件測量細(xì)胞的長度和寬度，計算長/寬比。

1.3.4細(xì)胞周期分析

取第3代細(xì)胞，消化重懸后以5×103個/ml的密度接種于24孔板內(nèi)，分別加入兩種培養(yǎng)基，每組3個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，胰酶消化采集細(xì)胞，以5×105個/ml的密度重懸于1 ml PBS中并反復(fù)振蕩形成單細(xì)胞懸液。加入2 ml冷無水乙醇，迅速混勻后4℃過夜固定細(xì)胞。用100 mg/ml PI（吉凱，中國）在4℃染色30 min。上流式細(xì)胞儀檢測，應(yīng)用Modifit軟件分析。計算G0/G1期、S期和G2期的細(xì)胞百分比。

1.3.5細(xì)胞增殖率測定

取第3代細(xì)胞，消化重懸后以3×105個/ml的密度接種于96孔板中。邊緣孔用無菌水填充。在培養(yǎng)到一定的時間（1、3、5、7 d）時，向每孔加入10 μl CCK 8溶液（日本同仁），將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度，檢測細(xì)胞增殖率并繪制細(xì)胞生長曲線。

1.3.6 hBMMSCs向成骨方向誘導(dǎo)

分別在A、B組中培養(yǎng)液內(nèi)加入經(jīng)典成骨誘導(dǎo)液（10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、10-8 mol/L 地塞米松、50 mg/L L-抗壞血酸）誘導(dǎo)其向成骨方向分化。

1.3.6.1堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）檢測? 將hBMMSCs細(xì)胞懸液以5×103個/ml的濃度接種于24孔板內(nèi)，分別加入兩種培養(yǎng)基，每組3復(fù)孔。48 h后加入成骨誘導(dǎo)液繼續(xù)培養(yǎng)。在誘導(dǎo)后第2、6、10、14、18天進(jìn)行檢測。吸出舊培養(yǎng)基，每孔加入300 μl 0.2% Triton X-100，4℃冰箱過夜，采用ALP檢測試劑盒（碧云天，中國），檢測ALP含量。

1.3.6.2成骨相關(guān)基因檢測? 以2×104個/ml的密度將細(xì)胞接種于24孔板內(nèi)，分別使用含有成骨誘導(dǎo)液的2種培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d。到時間后，用TRIzol（Invitrogen，美國）溶解細(xì)胞，收集細(xì)胞內(nèi)總RNA。將細(xì)胞集合到一起以獲得足夠的RNA量。每組等量的總RNA用Superscript Ⅱ first-strand cDNA試劑盒（Invitrogen，美國）反轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物的設(shè)計根據(jù)RUNX2、ALP、Ⅰ型膠原（COLⅠ）和骨鈣素（Osteocalcin，OC）的核苷酸序列進(jìn)行，利用引物設(shè)計軟件PrimerPrimer 5設(shè)計（表1），靶基因的表達(dá)水平用持家基因GAPDH的水平作標(biāo)準(zhǔn)化，使用熒光定量PCR（real time PCR）法檢測成骨相關(guān)基因含量。

1.3.6.3礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色? 以5×103個/ml的密度分接種于24孔板內(nèi)，分別加入兩種培養(yǎng)基。48 h后加入成骨誘導(dǎo)液繼續(xù)培養(yǎng)至14 d，吸出舊培養(yǎng)基，PBS緩沖液清洗3遍，體積分?jǐn)?shù)75%乙醇固定10 min，采用莤素紅染色的方法檢測礦化結(jié)節(jié)，染色完成后，用蒸餾水反復(fù)漂洗至不再脫色，顯微鏡檢并拍照。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。