彭帥，陳朗，鄭天宇，陸會寧，張麗，劉麗霞

（西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030）

Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）位于單核/巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面，同時也表達于上皮/牛胚氣管細(xì)胞等非免疫細(xì)胞中，能識別細(xì)菌、病毒、寄生蟲等多種病原微生物，是動物機體重要的模式識別受體[1,2]。自Medzhitov等[3]發(fā)現(xiàn)第一個TLRs以來，至今已有10余個家族成員[4]。它們通過感知病原微生物（如細(xì)菌、真菌等）表達的特異性結(jié)構(gòu)，即病原分子相關(guān)模式（PAMPs）和某些內(nèi)源性配體，傳導(dǎo)病原微生物入侵信號并釋放炎癥因子等免疫活性物質(zhì)，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生固有免疫應(yīng)答，進一步激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答[5]。TLR2是一種跨膜糖蛋白，能夠識別病原體的細(xì)胞壁成分，激活免疫細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)機制，使機體產(chǎn)生抗病性。目前，已經(jīng)證實牛TLR2基因被定位于17號染色體上[6]。TLR2作為固有免疫和適應(yīng)性免疫之間的橋梁，在機體中發(fā)揮著重要作用[7]，成為?？共∮N的候選標(biāo)記基因。

近年來，研究者對牛TLR2基因的結(jié)構(gòu)功能、多態(tài)性及其與疾病的相關(guān)性做了大量研究。孫麗萍等研究表明，牛TLR2存在3個突變位點[8]。林寶山等利用熒光定量PCR，研究發(fā)現(xiàn)TLR2基因在牦牛小腸中有高表達現(xiàn)象[9]，且TLR2能識別并結(jié)合牛腸中的微小隱孢子蟲[10]。董慧敏[11]、葉小康[12]研究發(fā)現(xiàn)，病原微生物感染奶牛子宮后TLR2基因mRNA表達量明顯增加，并分析了其與子宮內(nèi)膜炎的關(guān)聯(lián)性。Bhaladhare等發(fā)現(xiàn)牛TLR2基因存在3個SNP位點，并分析了其與結(jié)核病的相關(guān)性[13]。這些研究表明TLR2基因與許多免疫性疾病有關(guān)聯(lián)，并在調(diào)控免疫機理方面具有重要作用。

目前，有關(guān)大通牦牛TLR2基因的生物信息學(xué)研究還未見報道，為進一步探究其功能和作用機理，本研究采用DNA混合池擴增后直接測序的方法獲得大通牦牛TLR2基因CDS區(qū)（編碼區(qū)Coding regions），并利用生物信息學(xué)軟件及網(wǎng)站預(yù)測分析大通牦牛TLR2蛋白的結(jié)構(gòu)功能，為揭示該基因的基本性質(zhì)和功能信息以及大通牦牛的抗病育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗血樣

本研究的試驗血樣采自青海大通牦牛種牛場的55頭大通牦牛，對其進行頸靜脈采血，采全血10mL，加ACD抗凝劑抗凝，利用傳統(tǒng)的苯酚-氯仿法抽提基因組DNA[14]。大通牦?；蚪MDNA以0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2 引物設(shè)計與合成

參考GenBank數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的奶牛TLR2基因序列（登錄號AF368419），并引用周峰等已經(jīng)設(shè)計好的TLR2基因特異性引物[15]，分成五段進行擴增，預(yù)期擴增片段長度分別為522bp、822bp、574bp、526bp、599bp（表1）。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

表1 大通牦牛TLR2基因CDS區(qū)引物序列

1.3 DNA混合池構(gòu)建與PCR擴增

55個大通牦?；蚪MDNA樣品各取2μL，構(gòu)建一個DNA混合池，以DNA混合池為模板進行擴增。擴增體系為20μL：DNA模板0.8μL，上下游引物各0.4μL，2×Power Taq PCR Master Mix 11μL，ddH2O 7.4μL。PCR條件：94℃ 5min預(yù)變性，94℃ 30s變性，58.5℃ 30s退火，72℃ 50s延伸，30次循環(huán)，72℃10min延伸，4℃保存。PCR擴增產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 序列測定與拼接

五段PCR產(chǎn)物直接送蘇州金唯智生物科技有限公司進行純化后雙向測序，并使用MEGA6軟件[16]對大通牦牛TLR2基因CDS區(qū)進行拼接。

1.5 生物信息學(xué)分析

利用生物信息學(xué)軟件及網(wǎng)站對大通牦牛TLR2蛋白結(jié)構(gòu)、功能等進行預(yù)測與分析，所用軟件及網(wǎng)站見表2。

表2 生物信息學(xué)分析網(wǎng)站及軟件

2 結(jié)果與分析

2.1 大通牦牛TLR2蛋白理化性質(zhì)預(yù)測分析

利用BioEdit軟件和ExPASy的在線程序Protparam預(yù)測TLR2蛋白的分子式、相對分子質(zhì)量、等電點和氨基酸組成等基本性質(zhì)（表3）。結(jié)果顯示，大通牦牛TLR2基因編碼784個氨基酸，20種氨基酸占比見圖1，亮氨酸（Leu）最多，占總氨基酸的15.43%，甲硫氨酸（Met）占比最少（1.40%）。

表3 大通牦牛TLR2蛋白質(zhì)理化性質(zhì)

圖1 大通牦牛TLR2蛋白質(zhì)氨基酸組成

2.2 大通牦牛TLR2跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

應(yīng)用TMHMM Server V.2.0分析跨膜結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，大通牦牛TLR2蛋白可能是由胞外區(qū)（1～587aa）、跨膜區(qū)（588～610aa）、胞內(nèi)區(qū)（611～784aa）三部分組成的跨膜蛋白（圖2）。利用CDD工具[22]預(yù)測TLR2蛋白膜外區(qū)富集亮氨酸重復(fù)序列，可輔助識別病原微生物。

圖2 大通牦牛TLR2蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.3 大通牦牛TLR2蛋白信號肽預(yù)測分析

運用Signal P4.1軟件預(yù)測大通牦牛TLR2蛋白的N端信號肽及剪切位點，其準(zhǔn)確度可達96%[23]。結(jié)果顯示，Cmax（0.692）、Ymax（0.800）均趨向于+1，S值在剪切位點之前連續(xù)偏高，剪切位點之后急劇降低，說明大通牦牛TLR2具有信號肽，剪切位點存在于20～21位氨基酸之間（圖3）。

圖3 大通牦牛TLR2信號肽預(yù)測

2.4 大通牦牛TLR2蛋白N-糖基化位點預(yù)測分析

圖4 大通牦牛TLR2蛋白N-糖基化位點預(yù)測

利用CBS的在線程序NetNGlyc預(yù)測大通牦牛TLR2蛋白的N-糖基化位點（圖4）。結(jié)果顯示，TLR2蛋白具有3個潛在的N-糖基化位點，分別為114位點、199位點和442位點。

2.5 大通牦牛TLR2 mRNA二級結(jié)構(gòu)

利用在線程序（RNA fold web server 服務(wù)器）預(yù)測大通牦牛TLR2 mRNA二級結(jié)構(gòu)（圖5）。結(jié)果顯示，其自由能為-677.40 kcal/mol，與荷斯坦牛二級結(jié)構(gòu)自由能相差微小，但二級結(jié)構(gòu)構(gòu)型發(fā)生明顯變化[24,25]。

圖5 大通牦牛TLR2 mRNA二級結(jié)構(gòu)

3 討論

TLR2作為TLRs的家族成員之一，活性居于前列，可與其他TLRs（如TLR1、TLR6）以及受體（如CD14）結(jié)合，產(chǎn)生強烈的免疫效應(yīng)。目前國內(nèi)外對于人及荷斯坦牛、鼠、鴨和羊等動物TLR2基因的研究已有大量報道[24～28]。

本研究通過蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)、信號肽、糖基化位點和mRNA二級結(jié)構(gòu)分析TLR2基因的結(jié)構(gòu)及功能。從預(yù)測結(jié)果看，TLR2蛋白是由784個氨基酸組成的不穩(wěn)定親水性跨膜蛋白質(zhì)。大通牦牛TLR2蛋白理論等電點為6.46，由此可判斷大通牦牛TLR2蛋白是一種弱酸性蛋白質(zhì)。研究表明蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)大于40為不穩(wěn)定蛋白，反之則為穩(wěn)定蛋白[29]，大通牦牛TLR2蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為42.22，屬于不穩(wěn)定蛋白。依據(jù)總平均親水性（-0.120），可判斷大通牦牛TLR2蛋白是可溶性蛋白。通常蛋白質(zhì)半衰期越長其結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，大通牦牛TLR2蛋白半衰期為30h，但其卻是不穩(wěn)定蛋白，可能由于不同基因發(fā)揮不同功能而產(chǎn)生的相反結(jié)果。大通牦牛TLR2蛋白是由胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)構(gòu)成的跨膜蛋白，與南陽黃牛TLR2蛋白組成一致[15]。研究表明牛TLR2可通過NF-Κb途徑誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-1β的產(chǎn)生[30]，大通牦牛TLR2蛋白可能含有20個氨基酸組成的信號肽，南陽黃牛TLR2蛋白含有21個氨基酸組成的信號肽[15]，差別可能由于TLR2在不同種屬之間指導(dǎo)蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)移及分泌的功能強度差異所造成。蛋白質(zhì)糖基化修飾對蛋白質(zhì)折疊、分選及其定位有重要影響，大通牦牛TLR2蛋白具有3個潛在的N-糖基化位點，可能與其抗病性有關(guān)聯(lián)。mRNA二級結(jié)構(gòu)同荷斯坦牛有明顯變化，可能與其優(yōu)越的抗寒性有關(guān)聯(lián)。

本研究對大通牦牛TLR2蛋白的理化性質(zhì)和功能結(jié)構(gòu)進行了預(yù)測分析，此后可在此基礎(chǔ)上深入研究TLR2基因的相對表達量，為大通牦牛的抗病育種提供理論基礎(chǔ)。