戴宛平 潘瑤 康倩若 任雪敏 陽小飛 劉孟雪

關(guān)鍵詞 細(xì)胞分化 背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞 底物成分 多聚賴氨酸

中圖分類號(hào)：R338.1 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? DOI：10.16400/j.cnki.kjdkz.2019.10.039

Abstract Dorsal root ganglion cells （DRG） are important cells in the peripheral nervous system to sense and transmit pain. Polylysine is a common extracellular matrix （ECM） for nerve cells cultured in vitro. However， the specific effects of different types and concentrations of polylysine on the growth and differentiation of dorsal root ganglion cells have not yet been clarified. Objective： To investigate the effects of polylysine of different types， concentration and molecular weight on the growth and differentiation of rat dorsal root ganglion cells. Methods： The effects of D-type and L-type polylysine on the differentiation rate and average process length of rat dorsal root ganglion cells were studied from three aspects： time gradient， concentration gradient and molecular weight. Results： The results showed that L-polylysine could promote the length of cell processes at 48 hours in normal working concentration. When the concentration of D-polylysine and L-polylysine decreased to 5 ug/ml and 20 ug/ml respectively， the cells differentiated better on L-polylysine-coated slide， while the normal molecular weight （3-7W） or high molecular weight （>3 ug/ml） were better. 0 W） D-polylysine had no significant effect on the growth and differentiation of dorsal root ganglion cells.

Keywords cell differentiation; dorsal root ganglia; substrate composition; Polylysine

0 前言

背根神經(jīng)節(jié)（Dorsal Root Ganglion， DRG）神經(jīng)細(xì)胞是外周神經(jīng)系統(tǒng)中感受、傳導(dǎo)痛覺的重要細(xì)胞。[1]背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞在周圍神經(jīng)系統(tǒng)有重要的作用，在神經(jīng)保護(hù)、神經(jīng)損傷后的修復(fù)及神經(jīng)軸突體外延長培養(yǎng)和熱痛等傷害性刺激對(duì)離子通道的影響等生物學(xué)實(shí)驗(yàn)以及相關(guān)的藥理學(xué)研究中扮演著重要的角色。[2]

神經(jīng)細(xì)胞生長分化是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的重要步驟，需要細(xì)胞內(nèi)多種蛋白及細(xì)胞外基質(zhì)共同作用來調(diào)控。有研究報(bào)道，細(xì)胞外基質(zhì)成分是影響背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞生長分化的因素之一。多聚賴氨酸是神經(jīng)細(xì)胞體外培養(yǎng)常用的ECM。[3]常用的多聚賴氨酸有L型（L-PL）和D型（D-PL）兩種，由于其親水性質(zhì)易于細(xì)胞貼壁生長，常用于細(xì)胞培養(yǎng)。但不同類型、不同濃度以及不同分子量（相對(duì)分子質(zhì)量）的多聚賴氨酸對(duì)背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞生長分化的具體影響目前仍不清楚。本項(xiàng)目計(jì)劃通過改變多聚賴氨酸類型（L型與D型）、濃度、分子量，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞的分化率和平均突起長度，來觀察ECM對(duì)背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞生長分化的影響，為研究ECM調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞生長分化的機(jī)制提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

80g SD雄鼠。

1.2 方法

1.2.1 背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

取出老鼠脊柱，并沿脊椎剖成兩半，從脊髓側(cè)面取出背根神經(jīng)節(jié)（DRG）。剔凈DRG周圍的組織并充分剪碎至糊狀。將剪碎后的DRG放入2ml消化酶中消化30min，每隔5min拿出來輕輕吹打。取出一滴消化液，放置顯微鏡下觀察，若看到消化成單個(gè)渾圓的細(xì)胞，則停止消化，否則繼續(xù)消化。消化結(jié)束加入3mL培養(yǎng)基，1000 g離心3min。棄上清，加適量培養(yǎng)基，重懸。滴片，將細(xì)胞放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h使其貼壁，待細(xì)胞貼壁后加入培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.2 固定及細(xì)胞成像

固定：吸出培養(yǎng)基，每孔加入400 l 4%的PFA溶液，室溫下固定15 min，貼片。

細(xì)胞成像：貼片后，每類樣本在激光共聚焦顯微鏡放大60倍下分別隨機(jī)選取6-10個(gè)視野，進(jìn)行成像處理。

2結(jié)果

2.1 常用工作濃度L、D型多聚賴氨酸對(duì)DRG生長分化的影響

本次實(shí)驗(yàn)通過統(tǒng)計(jì)比較DRG細(xì)胞的分化率，平均突起長度，觀察D型和L型多聚賴氨酸對(duì)細(xì)胞生長分化的影響。常用工作濃度為100 g/ml的L-PL及25 g/ml的D-PL，用這些ECM包被玻片，超純水水洗晾干后培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)某個(gè)細(xì)胞的突起總長度大于這個(gè)細(xì)胞胞體直徑的2倍時(shí)，我們一般認(rèn)為此細(xì)胞屬于已分化細(xì)胞。分別對(duì)培養(yǎng)12 h、24 h、48 h、72 h的DRG 細(xì)胞統(tǒng)計(jì)分析分化率和突起長度，結(jié)果如圖1所示。

從圖1 （A）可知，在12-72 h的分化率沒有顯著差異，說明在72 h 內(nèi)，L和D型多 聚賴氨酸對(duì)DRG細(xì)胞的分化率的影響無顯著差異，而從圖1 （B）可知，培養(yǎng)至48 h時(shí)DRG的平均突起長度有明顯差異（進(jìn)行t檢驗(yàn)可得P值小于0.01）。因此，我們可以認(rèn)為，L型多聚賴氨酸在細(xì)胞成長48 h時(shí)對(duì)細(xì)胞的突起長度有一定的促進(jìn)作用。

2.2 不同濃度梯度L、D型多聚賴氨酸對(duì)DRG生長分化的影響

從第一階段實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，以100 g/ml L-PL和25 g/ml D-PL作為細(xì)胞外基質(zhì)時(shí)，培養(yǎng)至48h的DRG細(xì)胞平均突起長度差異顯著，但其對(duì)分化率的影響無顯著差異。那么影響DRG細(xì)胞分化率的因素是什么，升高或降低ECM濃度，是否會(huì)對(duì)其分化率造成影響？

因此我們?cè)O(shè)計(jì)不同濃度梯度的多聚賴氨酸包被的玻片培養(yǎng)DRG細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞生長 48h時(shí)細(xì)胞的分化率，即L型多聚賴氨酸濃度為L-20 g/ml，L-100 g/ml，L-500 g/ml，D型多聚賴氨酸的濃度為D-5 g/ml，D-25 g/ml，D-125 g/ml，培養(yǎng)至48 h，計(jì)算其分化率。此時(shí)濃度梯度的對(duì)照關(guān)系為：D-5 g/ml & L-20 g/ml，D-25 g/ml & L-100 g/ml，D-125 g/ml & L-500 g/ml。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖2所示。

2.3 不同分子量D型多聚賴氨酸對(duì)DRG生長分化的影響

制備工藝不同，會(huì)產(chǎn)生不同相對(duì)分子質(zhì)量的多聚賴氨酸，分別使用相對(duì)分子質(zhì)量為3-7 W和>30 W（高分子）的工作濃度下D-PL包被玻片，計(jì)算其分化率與平均突起長度，結(jié)果如圖3所示。

3討論

背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞是周圍神經(jīng)系統(tǒng)主要的傳入初級(jí)神經(jīng)元，在不同刺激對(duì)膜離子通道的影響等生理學(xué)研究中起重要作用，[1]由于DRG細(xì)胞具有在體外生存能力強(qiáng)的特點(diǎn)，且從大鼠中取材較為方便，因此在本課題中，選用80 g SD雄鼠作為實(shí)驗(yàn)材料。[2]

有研究表明，細(xì)胞外基質(zhì)成分是影響背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞生長分化的因素之一，[4]為提高神經(jīng)細(xì)胞的分化率與存活率，需選擇合適的細(xì)胞外基質(zhì)。目前常用多聚賴氨酸作為培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)的細(xì)胞外基質(zhì)。[5]

經(jīng)本課題研究發(fā)現(xiàn)，ECM為25 g/ml D-PL和100 g/ml L-PL時(shí)，DRG細(xì)胞在12-72 h的分化率沒有顯著差異，培養(yǎng)至48 h時(shí)DRG的平均突起長度有明顯差異，被L-PL包被的玻片上DRG平均分支長度較長，因此，我們認(rèn)為在細(xì)胞成長48 h時(shí)L-PL會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的生長;改變兩種多聚賴氨酸濃度后，L-PL和D-PL培養(yǎng)至48 h時(shí)的細(xì)胞分化率僅在5 g/ml的D-PL和20 g/ml的L-PL的一組對(duì)照下存在顯著差異，具體表現(xiàn)為被L-PL包被的玻片上DRG細(xì)胞分化率較高，而在25 g/ml D-PL和100 g/ml L-PL及125 g/ml D-PL和500 g/ml L-PL兩組對(duì)照下無明顯差異，我們初步猜測(cè)低濃度的L-PL更有利于DRG細(xì)胞的生長分化;改用不同分子量的25 g/ml D-PL培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)ECM為高分子量與普通分子量的D型多聚賴氨酸時(shí)，DRG的突起數(shù)與分化率不存在顯著性差異，說明常用濃度下D型多聚賴氨酸的分子量對(duì)DRG的生長分化無顯著影響。查閱相關(guān)文獻(xiàn)可知，[3，6，7，8]多聚賴氨酸的相對(duì)分子質(zhì)量可能會(huì)影響到神經(jīng)元的聚集現(xiàn)象，但對(duì)其影響機(jī)制還需進(jìn)一步的研究。

*通訊作者：陽小飛 ?劉孟雪

本研究由國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31670850）;中南民族大學(xué)科學(xué)基金引進(jìn)人才科研啟動(dòng)基金自科項(xiàng)目（ZZ13002）資助

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