何九軍 張少飛 趙淑玲

摘要 通過組織培養(yǎng)香玲核桃，對不同時間中核桃苗的褐化現(xiàn)象進(jìn)行觀察，并提出了影響其褐化現(xiàn)象的一些因素。結(jié)果表明，初代培養(yǎng)采用改良DKW為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加1 g/L活性炭，核桃外植體用0.1%升汞消毒2 min后，褐化率最低。

關(guān)鍵詞 核桃;組織培養(yǎng);褐化;觀察

中圖分類號：S664.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：2095-3305（2019）04-005-02

DOI： 10.19383/j.cnki.nyzhyj.2019.04.002

Abstract The browning phenomena of walnut seedlings at different time were observed by tissue culture，and some factors affecting the browning were put forward. The results showed that the browning rate of walnut explants was the lowest when they were disinfected with 0.1% mercury for 2 minutes on the basis of modified DKW medium and 1 g/L activated carbon.

Key words ? Walnut;Tissue culture;Browning;Observation

核桃是食療佳果，含有大量脂肪和蛋白質(zhì)極易被人體吸收，其中蛋白質(zhì)中含有對人體極為重要的賴氨酸，對大腦神經(jīng)的營養(yǎng)極為有益。核桃具有獨(dú)特的滋補(bǔ)、營養(yǎng)、保健作用，常吃核桃不僅能滋養(yǎng)血脈，增進(jìn)食欲，烏黑須發(fā)，而且還能醫(yī)治性功能減退、神經(jīng)衰弱、記憶衰退、腎結(jié)石及潤腸通便等;對骨骼系統(tǒng)有益處，有防癌、防輻射作用，經(jīng)常使用電腦者更視其為保健護(hù)膚的佳品;具有抗衰老作用，可以從多方面保護(hù)心血管系統(tǒng)，能預(yù)防心腦血管疾病。

褐變是由組織中的酚類物質(zhì)經(jīng)多酚氧化酶（PPO）氧化后產(chǎn)生棕褐色的醌類物質(zhì)造成的[1]。外植體褐變是核桃苗褐變的主要方面，一般外植體褐變的發(fā)生受多因子影響。劉淑蘭[2]在核桃組培試驗中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中無機(jī)鹽含量和激素濃度、培養(yǎng)溫度、外植體自身生理狀態(tài)等都與褐變程度有關(guān)，較高培養(yǎng)溫度（25±2）℃、培養(yǎng)基中較高無機(jī)鹽濃度、較高激素濃度及木質(zhì)化程度高的外植體都會促進(jìn)褐化的發(fā)生。張小紅等[3]以香玲核桃休眠芽和新生枝芽莖段作為試材進(jìn)行褐化研究，發(fā)現(xiàn)嫩枝莖芽的褐化死亡率顯著高于休眠芽和半木質(zhì)化莖芽，不但褐化死亡率較低，而且腋芽萌發(fā)率顯著高于休眠芽。由此可見，不同芽位的外植體因木質(zhì)化程度及其代謝活動存在著差異，在培養(yǎng)過程中褐化程度也不一樣。此外，外植體的大小及傷害程度也是影響褐變發(fā)生的因素之一。另外，接種時各種消毒劑對外植體的傷害也會引起褐化。張建成等[4]研究認(rèn)為，新改良的DKW培養(yǎng)基上的核桃試管芽苗較改良DKW培養(yǎng)基生長健壯，增殖率高;核桃試管芽苗繼代增殖的最適pH為6.2;變溫培養(yǎng)（光照期25℃±3℃，黑暗期18℃±2℃）較恒溫培養(yǎng)（25℃±3℃）適于核桃試管芽苗的繼代增殖。筆者通過組培觀察了核桃苗褐變的過程，并提出了影響核桃苗褐變的一些因素。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

香玲核桃在甘肅成縣核桃科技示范園采集。試驗儀器有燒杯、天平、滅過菌的培養(yǎng)皿、剪刀、濾紙、酒精燈、計時器、紗布、托盤、錐形瓶、廢液罐、一次性手套、玻璃棒、鑷子、超凈工作臺（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）、LDZX？鄄50KBS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）。試驗試劑有6？鄄BA、IBA、IAA、無菌水、酒精（75%）、升汞、注射用青霉素鈉（哈藥集團(tuán)）、蔗糖（天津市永大化學(xué)試劑有限公司）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、瓊脂粉、抗壞血酸（天津市大茂化學(xué)試劑廠）。

1.2 試驗過程

試驗用改良DKW作為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，瓊脂8 g/L，蔗糖30 g/L，按表1培養(yǎng)基配制稱取基本培養(yǎng)基、激素（6？鄄BA、IAA、IBA）、抗褐化劑（聚乙烯吡咯烷酮，PVP）、抗生素（青霉素），待瓊脂完全溶解后調(diào)pH為中性，用50 ml三角瓶進(jìn)行分裝;分別標(biāo)記為H1、H5與H6，不同配方培養(yǎng)基分別制作30瓶，核桃莖段外植體先用自來水流水沖洗10～14 h，再分別用0.1%升汞消毒0.5、1、2 min后接入錐形瓶。

分別用不同的吸附劑VC、PVP、Na2S2O3、活性炭添加在DKW培養(yǎng)基中，用流水沖洗的核桃莖段作外植體，0.1%升汞消毒2 min，分別植入添加有VC、PVP、Na2S2O3、活性炭等吸附劑的錐形瓶中，每一吸附劑制作培養(yǎng)基30瓶。

按以上方法得到的錐形瓶，放于隴南師范高等?？茖W(xué)校農(nóng)林技術(shù)學(xué)院植物組織培養(yǎng)室，培養(yǎng)條件為溫度20～25℃，12 h光照。每天觀察記錄，統(tǒng)計褐化、污染及新芽的發(fā)生。

1.3 觀察并記錄

在核桃組織培養(yǎng)中，外植體的褐化現(xiàn)象較為普遍[4]，有不少學(xué)者采用添加不同劑量的活性炭管、Na2S2O3、VC、PVP等抑制褐化現(xiàn)象，取得較好的效果[5-7]。經(jīng)過前期試驗準(zhǔn)備，確定每升培養(yǎng)基中添加2 g PVP和0.5 g VC。在12、72、144 h時觀察并記錄H1、H5、H6 培養(yǎng)基上核桃苗的褐化現(xiàn)象（圖1～3）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方式和培養(yǎng)基對核桃苗褐化的影響

從圖1可以看出，核桃外植體的褐化在第1次觀察（12 h）就有發(fā)生，隨時間的推移，褐化現(xiàn)象會進(jìn)一步加強(qiáng)，輕度是外植體底部與培養(yǎng)基接觸面發(fā)生褐化，到后期整個外植體以及培養(yǎng)基均發(fā)生褐化（圖2～3）。

用0.1%的升汞處理外植體，處理時間分別是0.5、1、2 min，發(fā)現(xiàn)不同的消毒方式H1、H5、H6 3種培養(yǎng)基上的表現(xiàn)不同，褐化率不同，其中H5培養(yǎng)基的褐化率較為穩(wěn)定，保持在50%左右，H6培養(yǎng)基的褐化率較高，在升汞消毒0.5 min條件下，褐化率達(dá)到70%。H6培養(yǎng)基在升汞消毒2 min處理下，褐化率得到抑制，控制在30%以內(nèi)，說明升汞的處理時間和褐化率有一定的相關(guān)性。

由圖4可知，3種培養(yǎng)基中，H6培養(yǎng)基中的核桃苗褐化最少，褐化率不到40%，可見H6（改良的DKW+6-BA 10 g/ml+IAA 50 g/ml+PVP+抗生素）的培養(yǎng)基褐化最好。

2.2 不同吸附劑對核桃苗褐化的影響

核桃的褐化問題一直受到很多學(xué)者的關(guān)注，用不同的吸附劑，如VC、PVP、Na2S2O3、活性炭等可以在一定程度上抑制褐化。由表2可知，用不同吸附劑處理的外植體，其褐化率表現(xiàn)不同，VC、PVP、Na2S2O3、活性炭的褐化率分別是30.0%、16.7%、20.0%和13.3%，可以看出這幾種吸附劑對褐化都有一定的抑制，在DKW培養(yǎng)基上，VC處理的褐化率最高，活性炭處理的褐化率最低，表明DKW培養(yǎng)基中添加活性炭對核桃外植體的褐化現(xiàn)象有較好的抑制作用。

3 結(jié)論與討論

隴南是核桃的原產(chǎn)區(qū)，從20世紀(jì)國家實(shí)行退耕還林以及當(dāng)?shù)卣捎枚喾N方式栽種經(jīng)濟(jì)林以來，成縣以獨(dú)特的氣候地理優(yōu)勢成為核桃的優(yōu)勢栽培區(qū)，核桃也成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)民的重要經(jīng)濟(jì)來源之一。優(yōu)良品質(zhì)的核桃一直是人們的需要。通過植物組織培養(yǎng)的方式獲得優(yōu)質(zhì)的核桃苗，可以為當(dāng)?shù)氐姆鲐氈Α?

升汞是植物組織培養(yǎng)中常用的消毒劑[8]，核桃近端用0.1%升汞分別消毒0.5、1、2 min，在不同的培養(yǎng)基上抑制褐化的效果不同，其中以H6（改良的DKW+6？鄄BA 10 g/ml+IAA 50 g/ml+PVP+抗生素）培養(yǎng)基的褐化抑制效果最好。

木本植物在組織培養(yǎng)中，褐化的抑制是初代培養(yǎng)的關(guān)鍵點(diǎn)。褐化的發(fā)生因植物的種類、外植體和培養(yǎng)基的類型不同而不同[9]，一般普遍認(rèn)為褐化的發(fā)生是植物體內(nèi)多酚氧化酶（PPO）與酚類物質(zhì)相互作用引起的[10]。對褐化的防治，可以在培養(yǎng)基中添加吸附劑、抗氧化劑、活性炭[11]。該試驗中，核桃外植體用VC、PVP、Na2S2O3、活性炭4種不同的吸附劑及抗氧化劑進(jìn)行防治褐化，發(fā)現(xiàn)這幾種吸附劑對褐化都有一定的抑制，VC、PVP、Na2S2O3、活性炭的褐化率分別是30.0%、16.7%、20.0%和13.3%，在DKW培養(yǎng)基上，VC處理的褐化率最高，活性炭處理的褐化率最低。

褐化的原因多種多樣，外植體、消毒、培養(yǎng)基等都有可能引起褐化。該試驗中初代培養(yǎng)采用改良DKW為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加1 g/L活性炭，核桃外植體用0.1%升汞消毒2 min后，褐化率最低。如何將褐化控制到最低，還需要進(jìn)一步研究。

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責(zé)任編輯：鄭丹丹