王燕鴿 張志琴 郭富禮

摘要 目的：基于多指標(biāo)成分定量評(píng)價(jià)分析復(fù)方魚腥草膠囊，為復(fù)方魚腥草膠囊的質(zhì)量控制提供參考。方法：首先制備復(fù)方魚腥草膠囊供試品溶液及槲皮苷、表告依春、綠原酸、連翹苷、黃芩苷對(duì)照品溶液，色譜條件采用CAPCELL-PAK-MG-C18色譜柱（5 μm，規(guī)格：4.6 mm×250 mm），柱溫以35 ℃為宜，進(jìn)樣量為10 μL，流速為1.0 mL/min進(jìn)行高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)，以流動(dòng)相A（乙腈）和流動(dòng)相B（水+0.01%磷酸）為條件進(jìn)行梯度洗脫，優(yōu)化高效液相（HPLC）的方法學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)性，進(jìn)行線性回歸、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、專屬性試驗(yàn)和加樣回收率試驗(yàn)，多指標(biāo)成分定量分析樣品中槲皮苷、表告依春、綠原酸、連翹苷和黃芩苷的含量。結(jié)果：1）采用HPLC色譜法對(duì)復(fù)方魚腥草膠囊中魚腥草、板藍(lán)根、金銀花、連翹、黃芩等進(jìn)行專屬性試驗(yàn)，結(jié)果顯示復(fù)方魚腥草膠囊中魚腥草、板藍(lán)根、金銀花、連翹、黃芩專屬性良好。2）線性范圍考察結(jié)果顯示槲皮苷對(duì)照品、連翹苷對(duì)照品、綠原酸對(duì)照品在4～201 μg/mL范圍內(nèi)、表告依春對(duì)照品、黃芩苷對(duì)照品在12～601 μg/mL范圍內(nèi)的線性關(guān)系均良好。3）精密度試驗(yàn)結(jié)果顯示槲皮苷、連翹苷、綠原酸、表告依春對(duì)照品、黃芩苷峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別是0.45%、0.52%、0.66%、0.59%、0.31%，結(jié)果表明此色譜條件下的HPLC儀器精密度良好。4）穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示復(fù)方魚腥草膠囊供試品溶液相對(duì)峰面積RSD是1.33%，表明24 h內(nèi)復(fù)方魚腥草膠囊供試品溶液基本穩(wěn)定。5）重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示復(fù)方魚腥草膠囊供試品溶液相對(duì)峰面積RSD為0.92%，表明該HPLC方法的重復(fù)性良好。6）結(jié)果顯示槲皮苷、表告依春、綠原酸、連翹苷和黃芩苷的平均回收率分別為99.10%、99.26%、99.07%、98.05%、98.82%、98.32%，RSD為1.81%、1.49%、0.94%、1.58%、1.01%，表明回收率較好。7）基于多指標(biāo)成分定量測(cè)定結(jié)果顯示不同廠家不同批次的復(fù)方魚腥草膠囊中有效成分槲皮苷、表告依春、綠原酸、連翹苷和黃芩苷的含量存在較大差異。結(jié)論：基于多指標(biāo)成分定量測(cè)定結(jié)果顯示不同廠家不同批次的復(fù)方魚腥草膠囊中有效成分槲皮苷、表告依春、綠原酸、連翹苷和黃芩苷的含量存在較大差異。

關(guān)鍵詞 多指標(biāo)成分定量;高效液相;復(fù)方魚腥草膠囊;槲皮苷;表告依春;綠原酸;連翹苷;黃芩苷

Abstract Objective：Based on the quantitative evaluation and analysis of compound Houttuynia cordata capsule based on multi-index components，it provides a reference for the quality control of compound Houttuynia cordata capsule.Methods：First，the compound Houttuynia capsule sample solution and quercetin were prepared，including Yichun，chlorogenic acid，forsythrin，baicalin reference solution，The chromatographic conditions were determined by high performance liquid chromatography（HPLC） with CAPCELL-PAK-MG-C18 column （5 μm， specification： 4.6 mm × 250 mm），column temperature 35 ℃，injection volume 10 μL，flow rate 1.0 mL/min）. Gradient eluting was carried out under the conditions of mobile phase A （acetonitrile） and mobile phase B （water 0.01% phosphate）.Optimize the methodological rigour of high performance liquid phase （HPLC），carry out linear regression， precision， reproducibility，stability，specificity test and sample recovery test，quantitative analysis of quercetin in samples with multiple index components，Quercetin， chlorogenic acid，The contents of phillyrin and baicalin.Results：1）the specific tests of Houttuynia cordata， Radix Isatidis， Flos Lonicerae， Forsythia suspensa and Scutellaria baicalensis were carried out by HPLC chromatography. the results showed that Houttuynia cordata， Radix Isatidis， Flos Lonicerae and Forsythia suspensa were found in the compound Houttuynia cordata capsule. Scutellaria baicalensis Georgi has a good specificity.2） the linear range of quercetin， phillyrin and chlorogenic acid were within the range of 4≤201 μg/mL， and the linear range of baicalin and baicalin were 12 μg/mL and 601 μg/mL， respectively. the linear range of quercetin， phillyrin and chlorogenic acid was 4≤201 μg/mL.3） the results of precision test showed that the relative standard deviation （RSD） of quercetin， phillyrin， chlorogenic acid and baicalin peak area were 0.45%， 0.52%， 0.66%， 0.59%， 0.31%， 0.51%， 0.52%， 0.56%， 0.59%， 0.31%， 0.52%， 0.62%， 0.59% and 0.31%， respectively. The results show that the precision of HPLC instrument under this chromatographic condition is good.4） The results of stability test showed that the relative peak area RSD of compound Houttuynia capsule solution was 1.33%， which indicated that the solution of compound Houttuynia capsule was basically stable within 24 hours.5） The results of reproducibility test showed that the relative peak area RSD of compound Houttuynia capsule solution was 0.92%， which indicated that the HPLC method had good reproducibility.6） The results showed that the average recovery of quercetin， eichun， chlorogenic acid， phillyrin and baicalin were 99.10%， 99.26%， 99.07%， 98.05%， 98.82%， 98.32%， 1.81% and 1.49%， respectively. 0.94%， 1.58%， 1.01%， indicating that the recovery is good.7）The results of quantitative determination based on multi-index components showed that the contents of quercetin， chlorogenic acid， phillyrin and baicalin in different batches of compound Houttuynia cordata Thunb capsules from different manufacturers were quite different.Conclusion：The results of quantitative determination based on multi-index components showed that the contents of quercetin， chlorogenic acid， phillyrin and baicalin in different batches of compound Houttuynia cordata Thunb capsules from different manufacturers were quite different.

Key Words Quantitative analysis of multiple index components;High performance liquid phase; Compound Houttuynia capsule;Quercetin;Biguoyichun;Chlorogenic acid;Forsythrin;Baicalin

中圖分類號(hào)：R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.05.013

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀（型號(hào)：SHIMADZU LC-20AD，廠家：日本島津有限公司）;二極管陣列（DAD）檢測(cè)器（型號(hào)：Prominence SPD-M20A，廠家：日本島津有限公司）;超聲波清洗儀（型號(hào)：DS1027HT/HTD，廠家：天津市富城達(dá)科技有限公司）。

1.2 試劑 色譜HPLC乙腈和色譜HPLC甲醇購(gòu)于德國(guó)MERCK公司，色譜HPLC冰醋酸、色譜HPLC磷酸和色譜HPLC無(wú)水乙醇均購(gòu)于天津百倫斯生物有限公司;中國(guó)食品藥品檢定研究院提供的槲皮苷對(duì)照品（批號(hào)：111538-201405）、表告依春對(duì)照品（批號(hào)：1072-93-113531）、黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)：0715-9909）、連翹苷對(duì)照品（批號(hào)：110821-201514）、綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：110753-201314）。

1.3 分析樣品 隨機(jī)選取10個(gè)不同廠家生產(chǎn)不同批次的復(fù)方魚腥草膠囊。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用CAPCELL-PAK-MG-C18色譜柱（5 μm，規(guī)格：4.6 mm×250 mm），柱溫以35 ℃為宜，進(jìn)樣量為10 μL，流速為1.0 mL/min進(jìn)行高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)，以流動(dòng)相A（乙腈）和流動(dòng)相B（水+0.01%磷酸）為條件進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 首先將槲皮苷對(duì)照品、表告依春對(duì)照品、黃芩苷對(duì)照品、連翹苷對(duì)照品、綠原酸對(duì)照品均分別放置于60 ℃真空干燥至恒重，然后分別精密稱取10.00 mg，其中，表告依春對(duì)照品置于100 mL量瓶中以甲醇定容，槲皮苷對(duì)照品和綠原酸對(duì)照品置于50 mL量瓶中以甲醇定容，連翹苷對(duì)照品置于25 mL量瓶中加入50%甲醇定容，黃芩苷對(duì)照品置于25 mL量瓶中加入無(wú)水乙醇適量，均超聲溶解，即制備得對(duì)照品溶液。精密量取所制備2 mL槲皮苷對(duì)照品溶液和綠原酸對(duì)照品溶液、3 mL連翹苷對(duì)照品溶液、10 mL黃芩苷對(duì)照品溶液、25 mL表白依春對(duì)照品溶液于50 mL量瓶中，甲醇定容，超聲混合均勻，即得混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取出復(fù)方魚腥草膠囊的內(nèi)容物，并精密稱取3.0 g于20 mL的錐形瓶中，加入適量甲醇定容后以軟木塞塞緊瓶口，搖晃促進(jìn)內(nèi)容物充分溶解均勻后記錄重量，超聲處理（功率500 W）30 min后，并記錄溶液冷卻后重量，計(jì)算兩次重量差，以甲醇補(bǔ)齊致兩次重量相等，采用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾混合液制成供試品溶液。

2.4 專屬性試驗(yàn) 取同一供試品溶液根據(jù)2.3制備的供試品溶液，采用HPLC色譜法對(duì)復(fù)方魚腥草膠囊中魚腥草、板藍(lán)根、金銀花、連翹、黃芩等進(jìn)行專屬性試驗(yàn)，結(jié)果顯示復(fù)方魚腥草膠囊中魚腥草、板藍(lán)根、金銀花、連翹、黃芩專屬性良好。（由于圖譜較多，此處僅以黃芩作為代表，詳細(xì)見(jiàn)圖1）。

2.5 線性關(guān)系考察 槲皮苷對(duì)照品、連翹苷對(duì)照品和綠原酸對(duì)照品分別精密稱取10.00 mg置于50 mL量瓶中以甲醇定容，表告依春對(duì)照品、黃芩苷對(duì)照品30.00 mg置于50 mL量瓶中甲醇定容，均超聲溶解，均勻混合各對(duì)照品溶液即制備得混合對(duì)照品溶液。精密量1.0、2.0、5.0、10.0、25.0 mL混合對(duì)照品溶液分別置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖晃使其混合均勻。精密吸取10 μL，根據(jù)2.1色譜條件采用HPLC色譜法，記錄峰面積;以對(duì)照品的濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X），所測(cè)得的峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，槲皮苷回歸方程y=170 121X+867，r=0.999 9（n=5）;綠原酸回歸方程y=31 109X+353，r=0.999 8（n=5）;表告依春回歸方程y=17 112X+42.41，r=0.999 7（n=5）;連翹苷回歸方程y=33 909X+265，r=0.999 8（n=5）;黃芩苷回歸方程y=95 042X+198，r=0.999 9（n=5），結(jié)果表明，槲皮苷對(duì)照品、連翹苷對(duì)照品、綠原酸對(duì)照品在4～201 μg/mL范圍內(nèi)、表告依春對(duì)照品、黃芩苷對(duì)照品在12～601 μg/mL范圍內(nèi)的線性關(guān)系均良好。

2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取10 μL按照2.2配制的混合對(duì)照品溶液，根據(jù)2.1的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果顯示槲皮苷、連翹苷、綠原酸、表告依春對(duì)照品、黃芩苷峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別是0.45%、0.52%、0.66%、0.59%、0.31%，結(jié)果表明此色譜條件下的HPLC儀器精密度良好。

2.7 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 在室溫下精密吸取10 μL同一份根據(jù)2.3配制的復(fù)方魚腥草膠囊供試品溶液，配置后分別放置0、1、4、8、12、24 h后進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果顯示復(fù)方魚腥草膠囊供試品溶液相對(duì)峰面積RSD是1.33%，表明24 h內(nèi)復(fù)方魚腥草膠囊供試品溶液基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取10 μL同一批次根據(jù)2.3制備的復(fù)方魚腥草膠囊供試品溶液，在相同2.1的色譜條件下，在固定的高效液相分析儀上進(jìn)樣測(cè)定，重復(fù)檢測(cè)5次，結(jié)果顯示復(fù)方魚腥草膠囊供試品溶液相對(duì)峰面積RSD為0.92%，表明該HPLC方法的重復(fù)性良好。

2.9 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法，精密稱取5份已知含量的同一批號(hào)樣品各約0.5 g，分別精密加入20 mL混合對(duì)照品甲醇溶液（0.005 36 mg/mL），進(jìn)行回收率試驗(yàn)測(cè)定，計(jì)算結(jié)果顯示槲皮苷、表告依春、綠原酸、連翹苷和黃芩苷的平均回收率分別為99.10%、99.26%、99.07%、98.05%、98.82%、98.32%，RSD為1.81%、1.49%、0.94%、1.58%、1.01%，表明回收率較好。見(jiàn)表2～6。

2.10 樣品測(cè)定結(jié)果 復(fù)方魚腥草膠囊基于多指標(biāo)成分定量結(jié)果可見(jiàn)，不同廠家不同批次的復(fù)方魚腥草膠囊中有效成分槲皮苷、表告依春、綠原酸、連翹苷和黃芩苷的含量存在較大差異。見(jiàn)表7。

3 討論

復(fù)方魚腥草膠囊中所含的藥物均具有清熱解毒的功效，魚腥草、板藍(lán)根、連翹、金銀花和黃芩等5味藥物，相輔相成，相互作用，共奏清熱解毒的作用。在中醫(yī)的復(fù)方組成中，方中的每一味藥物都是不可或缺，至關(guān)重要的，因此在多指標(biāo)成分的選擇上，本研究選擇測(cè)定每一味藥物的有效成分，即魚腥草的槲皮苷、板藍(lán)根的表告依春、金銀花的綠原酸、連翹的連翹苷和黃芩的黃芩苷，而測(cè)定每一味藥物的有效成分含量，對(duì)中藥復(fù)方的質(zhì)量?jī)?yōu)劣判定和質(zhì)量控制是極其重要的[12]。因此在藥物提取溶劑的選擇上采用甲醇、70%甲醇、乙醇、70%乙醇作為預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索條件，提取時(shí)間以0.5 h、1.0 h和1.5 h作為摸索條件，提取方式選擇超聲提取和回流提取2種摸索條件[13]，結(jié)果顯示在超聲提取下70%甲醇，提取1 h對(duì)5種藥物的5種有效成分的提取效率最高。另外本研究中設(shè)計(jì)HPLC色譜法對(duì)復(fù)方魚腥草膠囊的專屬性進(jìn)行鑒別研究以對(duì)其5味藥物的組成進(jìn)行定性的質(zhì)量評(píng)價(jià)。由于組方的有效成分較多，若這些成分不具有專屬性，則在其他有效成分存在的情況下，對(duì)后續(xù)成分含量的檢測(cè)過(guò)程中就可能因?yàn)槌煞值南嗷ビ绊懚豢杀苊獾脑斐山Y(jié)果偏差[14]，故而在綜合樣品回收率、穩(wěn)定性、可重復(fù)性、精密度、線性考察的基礎(chǔ)上，對(duì)HPLC的最佳色譜條件進(jìn)行反復(fù)的試驗(yàn)和調(diào)整。本研究結(jié)果HPLC色譜圖顯示復(fù)方魚腥草膠囊中槲皮苷、表告依春、綠原酸、連翹苷和黃芩苷的專屬性良好;且在復(fù)方魚腥草膠囊的樣品檢測(cè)中結(jié)果顯示有效成分槲皮苷、表告依春、綠原酸、連翹苷和黃芩苷的含量存在較大差異。

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（2019-01-23收稿 責(zé)任編輯：王明）