凌嫘 閔銳 范伏元

〔摘要〕 目的 觀察疏風宣肺湯對慢性支氣管炎大鼠血清以及肺組織中腫瘤壞死因子（tumor nercrosis factor-α， TNF-α）的影響。方法 將60只SPF級大鼠，隨機分為空白組、生理鹽水組、宣肺止咳合劑組和疏風宣肺湯組，每組15只;空白組正常飼養(yǎng)，余組采用脂多糖-香煙煙霧誘導法造模成功后分別予以生理鹽水、宣肺止咳合劑、疏風宣肺湯灌胃，1周后行腹主動脈采血，剪下右肺，檢測血清中TNF-α濃度，肺組織中TNF-αmRNA、TNF-α蛋白以及p-p38 MAPK蛋白的表達。結果 在藥物干預7 d后，各組大鼠血清中TNF-α濃度以及肺組織中的TNF-α mRNA、TNF-α蛋白、p-p38 MAPK蛋白的表達差異性均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與空白組相比，疏風宣肺湯組，生理鹽水組、宣肺止咳合劑組中各檢測指標差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與生理鹽水組相比，疏風宣肺湯組和宣肺止咳含劑組差異有顯著性統(tǒng)計學意義（P<0.01或P<0.05）。結論 疏風宣肺湯能顯著降低慢支大鼠血清中TNF-α濃度以及肺組織TNF-α mRNA、TNF-α蛋白、p-p38 MAPK蛋白表達，減少p38 MAPK信號通路的活化可能是疏風宣肺湯有效防治慢性支氣管炎的機制之一。

〔關鍵詞〕 疏風宣肺湯;慢性支氣管炎;腫瘤壞死因子-α;p38 MAPK信號通路;動物實驗

〔中圖分類號〕R285.5;R259? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.06.007

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of Shufeng Xuanfei Decoction on tumor nercrosis factor-α （TNF-α） in serum and lung tissue of rats with chronic bronchitis. Methods A total of 60 SPF rats were randomly divided into a blank group， a normal saline group， a Xuanfei Zhike Mixture group and a Shufeng Xuanfei Decoction group， with 15 rats in each group. The blank group was fed normally， while the rest groups were given with normal saline， Xuanfei Zhike Mixture and Shufeng Xuanfei Decoction after successful modeling by lipopolysaccharide-cigarette smoke induction method. After 1 week， blood was collected from the abdominal aorta， the right lung was cut off， and the concentration of TNF-α in serum and the expressions of TNF-α mRNA， TNF-α protein and p-p38 MAPK protein in lung tissue were detected. Results After 7 d of medical intervention， the differences in the concentration of TNF-α in serum and the expressions of TNF-α mRNA， TNF-α protein and p-p38 MAPK protein in lung tissue of rats in each group were statistically significant （P<0.05）. Furthermore， compared with the blank group， the differences of indexes in the Shufeng Xuanfei Decoction group， the normal saline group and the Xuanfei Zhike Mixture group were statistically significant （P<0.05）. Compared with the normal saline group， the difference in the Shufeng Xuanfei Decoction group and the Xuanfei Zhike Mixture group was statistically significant （P<0.01 or P<0.05）. Conclusion Shufeng Xuanfei Decoction can significantly reduce the concentration of TNF-α in serum of rats with chronic bronchitis and the expressions of TNF-α mRNA， TNF-α protein and p-p38 MAPK protein in lung tissue. Reducing the activation of p38 MAPK signaling pathway may be one of the effective mechanisms for preventing and treating chronic bronchitis by Shufeng Xuanfei Decoction.

〔Keywords〕 Shufeng Xuanfei Decoction; chronic bronchitis; TNF-α; p38 MAPK signaling pathway; animal experiment

慢性支氣管炎（chronic bronchitis， CB），是以反復咳嗽、咳痰或伴有喘息為主要臨床癥狀的常見慢性非特異性呼吸系統(tǒng)疾病[1]，多因各種理化因素、長期感染引起的氣管、支氣管黏膜及其周圍組織的炎癥[2]。早期發(fā)作次數(shù)少且癥狀一般較輕微，晚期癥狀可長年存在，炎癥反應明顯，可并發(fā)阻塞性肺氣腫，更甚者并發(fā)肺源性心臟病、肺動脈高壓[3-4]。近年來，國內外有研究顯示腫瘤壞死因子-α（TNF-α）作為人體重要的炎癥因子，可通過激活信號通路p38 MAPK對慢性支氣管炎炎癥進展起重要作用[5]，故本研究從信號通路p38 MAPK出發(fā)，觀察疏風宣肺湯對慢性支氣管炎大鼠模型血清以及肺組織中TNF-α的影響，并闡明其可能作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與儀器

1.1? 動物

選用SPF級SD大鼠60只，體質量（200±20）g，雌雄各半，由湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心代購，實驗動物許可證號：SYXK2013（湘）-0005。實驗方案通過醫(yī)學實驗動物倫理委員會批準。

1.2? 藥物及試劑

疏風宣肺湯（前胡10 g，桔梗10 g，橘紅5 g，苦杏仁10 g，薄荷5 g，忍冬藤15 g，紫菀10 g，百部10 g，浙貝母10 g，蟬蛻5 g，藍布正15 g，甘草 3 g）飲片均購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，一煎加800 mL水，取汁300 mL;二煎加500 mL水，取汁200 mL;將2次煎汁混合，文火煎至膏狀（含生藥2 g/mL），冷藏備用。宣肺止嗽合劑（甘肅普安制藥有限公司，批號：CP002180309）;戊巴比妥鈉（上海浦山化工有限公司，250 g/瓶，批號：20151023）;脂多糖（美國Sigma公司，10 mg/瓶，用無菌注射用水制成水溶液，1 mg/mL）;生理鹽水（湖南科倫制藥有限公司，100 mL∶0.9 g，產品批號：H16100902）;免疫組化試劑盒（bioss公司）;RT-PCR試劑盒（Invitrogen公司）;引物由上海生物工程有限公司合成。

1.3? 主要儀器

FA-2004N型電子天平（上海精密科學儀器機械有限責任公司天平制造廠）;智能恒溫培養(yǎng)箱（上海冠森有限公司）;臺式離心機（上海離心機械研究所）;酶標檢測儀（美國Bio-Tek）;電泳儀（美國Bio-rad）;7500熒光定量PCR儀（Applied Biosystems公司）。

2 方法

2.1? 分組與造模

適應性喂養(yǎng)1周記錄所有大鼠的體質量，按完全隨機表法將60只SPF級大鼠分成空白組、生理鹽水組、宣肺止咳合劑組和疏風宣肺湯組，每組15只?？瞻捉M正常飼養(yǎng);造模組采用脂多糖-香煙煙霧誘導法建立模型[6]，每天在15 m3的密閉煙室中，以鋸末110 g，煙葉10 g，辣椒4 g，硫磺0.5 g點燃進行煙熏，濃度約為200 ng/m3，持續(xù)30 min，共49 d。分別在第28、40天時，以2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉成功后行氣管前正中皮膚小切口，鈍性分離皮下組織，暴露氣管，將預裝在1 mL注射器中的200 μg（200 μL）脂多糖注入氣管內，縫合肌肉及皮膚。造模49 d，參照劑量-體表面積換算公式（大鼠劑量=成人每日劑量×大鼠體質量與體表面積比值/人體質量與體表面積比值，單位為克）計算大鼠給藥量，疏風宣肺湯組、生理鹽水組、宣肺止咳合劑組每次給藥劑量為10 mL/kg[7]。3組均采用灌胃法給藥，每日2次，連續(xù)7 d?？瞻捉M正常飼養(yǎng)。

2.2? 造模成功評判標準

大鼠見皮膚欠光澤、毛發(fā)凌亂或枯槁，精神倦怠、自主活動減少、食欲食量減少，2/3的大鼠可以聞及氣道痰鳴音，并且出現(xiàn)咳嗽，哮鳴以及喘息氣促等呼吸困難癥狀表示造模成功[6]。

2.3? 標本采集及指標檢測

2.3.1? 標本采集? 末次灌胃前禁食12 h，評估大鼠一般情況，如：體質量、皮毛色澤、呼吸、精神狀態(tài)、食欲適量、自主活動情況。灌胃后2 h，3%戊巴比妥鈉（1.5 mL/kg）腹腔麻醉成功后固定大鼠于鼠板，常規(guī)消毒后行腹主動脈采血，分離出血清，56 ℃水浴30 min滅活，用0.22 μm微孔濾膜過濾，除菌，分裝，-80 ℃冰箱保存，雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）檢測血清TNF-α濃度。打開胸腔，暴露氣管及肺組織，以棉線結扎右肺門，剪下右肺，分成兩部分，一部分放入裝有4%多聚甲醛的EP管內固定，余下右肺裝入凍存管，-70 ℃保存。

2.3.2? ELISA法[8]檢測血清TNF-α濃度? （1）準備工作：雙蒸水稀釋濃縮洗滌液，配制標準品，稀釋生物素化抗體、酶結合物;（2）ELISA檢測：取出所需板條，除空白孔外，在其它各孔中分別加入血清上清液稀釋20倍，用封板膠紙封住反應孔，37 ℃水域孵育90 min，洗板4次，每孔加生物素化抗體工作液100 L，用封板膠紙封住反應孔，37 ℃水域孵育60 min，洗板4次，加酶結合物工作液100 L，封住板孔，37 ℃水域孵育30 min，洗板4次，每孔加顯色劑100 L，避光37 ℃水域孵育15 min，每孔加終止液林，混勻，即刻讀數(shù)，數(shù)值為吸光值;（3）計算樣品濃度（C），公式為

C=A/Kb

其中A為吸光值，K為吸收系數(shù)，b為吸收層厚度。

2.3.3? RT-PCR法[8]檢測各組肺組織中TNF-αmRNA的表達? 取出裝有肺組織的EP管，對肺組織行破碎細胞處理裂解，將裂解后的均勻液移至離心管內，放入高速離心機，調整參數(shù)為12 000 r/min，4 ℃離心5 min，取上清液入新的離心管中，加入0.2 mL三氯甲烷，離心15 min，取上清液至預處理的EP管中加入等體積異丙醇，顛倒混勻，室溫沉淀10 min，離心10 min，棄上清液，加入75%乙醇，顛倒混勻，離心5 min，棄上清液再離心，棄上清液，取一定量樣品在紫外分光度計上測OD值，估算RNA純度及含量，將產物室溫干燥沉淀2～5 min，加入適量的RNase-free水溶解沉淀，置于-80 ℃冰箱備用。按逆轉錄試劑盒說明將總RNA逆轉錄為cDNA。引物根據GenBank中大鼠的基因序列，使用Primer 5.0軟件設計TNF-α引物（正向引物：5’-TCCAGACCTCCAGGCGGTGTC-3’;反向引物：5’-GTTCAGACAGAAGAGCGTGGTG-3’;產物：269 bp），在ABI7500熒光定量擴增儀上完成熒光實時監(jiān)測PCR擴增，作出溶解曲線，收集熒光得到的曲線圖，用ABI7500熒光定量儀自帶的實時熒光定量PCR分析程序分析。

2.3.4? Western-blot檢測[9]肺組織TNF-α、p-p38

MAPK蛋白的表達? 將凍存管中肺組織通過破碎細胞處理裂解后放入無菌塑料離心管中，加入0.5 mL冷Lysis Buffer，手動勻漿10次，移至預冷的離心管中，4 ℃離心（10 000 r/min）5 min，取上清液至新的離心管中，分裝保存于-80 ℃冰箱，用PBS稀釋凍干標準品為2 000 L/mL的儲存液，將25 uL的標準品和樣本分別添加于微孔中，加入200 uLBCA工作液，蓋上孔板蓋，在37 ℃下孵育30 min后冷卻至室溫，測樣品的吸光值OD，根據標準曲線查得相應的蛋白含量。SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳，轉膜，封閉，封閉結束后TBS/T（1×TBS，1%tween-20）洗3次，5 min/次。一抗1∶1 000稀釋于抗體稀釋液中，膜于一抗4 ℃孵育過夜，TBS/T洗3次，5 min/次;二抗1∶1 000稀釋于封閉液中，膜于二抗室溫孵育1 h，TBS/T洗3次，5 min/次，TMB顯色5～10 min，用掃描儀掃描記錄PVDF膜上的蛋白條帶，紅外熒光掃描系統(tǒng)掃描圖像及相對定量，以積分吸光度（峰面積）代表蛋白條帶的信號強弱，以此對目的蛋白表達水平進行半定量比較，觀察TNF-α蛋白、p-p38 MAPK蛋白水平情況。

2.4? 數(shù)據統(tǒng)計分析

采用SPSS 21.0軟件對所得數(shù)據進行統(tǒng)計學分析，采用平均數(shù)“x±s”表示，各組均數(shù)的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為有統(tǒng)計學差異。

3 結果

3.1? 一般情況觀察

空白組大鼠精神狀態(tài)良好、活動敏捷、皮膚毛發(fā)光澤、食欲食量正常，呼吸頻率規(guī)整、無喘息氣促，體重無明顯變化。造模各組在第一次注入LPS一周以后，大鼠陸續(xù)出現(xiàn)痰鳴癥狀，背毛蓬松，偶爾有喘息、咳嗽癥狀，在第二次注入藥物后行動遲緩、皮膚欠光澤、毛發(fā)凌亂、呼吸急促逐漸明顯。灌胃過程中痰鳴、咳嗽癥狀仍存在，且生理鹽水組大鼠癥狀有加劇的趨勢，出現(xiàn)精神萎靡，食欲下降等表現(xiàn);疏風宣肺湯組經灌胃治療后觀察到大鼠氣促、喘息、食量情況有減輕趨勢;宣肺止咳合劑組癥狀亦有所改善。

3.2? 各組大鼠血清TNF-α濃度水平

與空白組相比，生理鹽水組、宣肺止咳合劑組、 疏風宣肺湯組大鼠血清中TNF-α濃度明顯增高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。宣肺止咳合劑組、疏風宣肺湯組兩組與生理鹽水組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且疏風宣肺湯組與宣肺止咳合劑組比較血清中TNF-α濃度更低，兩組存在差異，提示宣肺止咳合劑組與疏風宣肺湯組均能降低血清中TNF-α濃度水平，而疏風宣肺湯效果更明顯。見表1。

3.3? 各組大鼠肺組織中TNF-α mRNA、TNF-α蛋白、p-p38 MAPK蛋白表達含量

與空白組比較，生理鹽水組、宣肺止咳合劑組、疏風宣肺湯組大鼠肺組織中TNF-α mRNA、TNF-α蛋白、p-p38 MAPK蛋白表達明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示造模后大鼠肺組織中各觀察指標明顯增多。宣肺止咳合劑組、疏風宣肺湯組兩組肺組織中TNF-α mRNA、TNF-α蛋白、p-p38 MAPK蛋白表達含量均低于生理鹽水組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），疏風宣肺湯組各指標含量更低則提示疏風宣肺湯效果更明顯。結果見表2，圖1-2。

4 討論

慢性支氣管炎是一種氣道炎癥性疾病，是由于慢支氣道中中性粒細胞數(shù)顯著升高、過度激活細胞因子TNF-α等的釋放[10]，在中醫(yī)屬“內傷咳嗽”“喘證”等范疇[11]，內傷外感均可傷肺而引起咳嗽，但風為百病之長，故肺受邪侵首為風，明·李梴著《醫(yī)學入門》咳嗽總論中言“風乘肺咳，則鼻塞聲重，口干喉癢”，咳嗽一病，病初常以“風邪犯肺”，久則為慢性咳嗽階段[12]，以“風邪伏肺，肺氣上逆”為基本，故治當疏風宣肺、止咳化痰，疏風宣肺湯現(xiàn)代藥理學研究證明[13]疏風宣肺湯中大多數(shù)藥物均具有緩解氣道炎癥，減少氣道損傷程度。

大量研究表明[14-16]通路p38 MAPK與慢性支氣管炎有著密切的關系，表現(xiàn)為其激活與中性粒細胞、巨噬細胞數(shù)目及活性增加緊密相關，中性粒細胞的信號傳導中p38 MAPK是一個關鍵的參與者，可加劇中性粒細胞等炎性細胞在炎癥部位的聚集，從而加重炎癥反應，使氣道防御力降低，致使呼吸道感染不斷進展或反復發(fā)作。Snvegnago等[17]和svensson等[18]在不同的疾病模型中發(fā)現(xiàn)正常情況下TNF-α體內一般活性極低，但受各種生物、理化等刺激后如機體組織受損，尤其是急性感染性疾病的發(fā)作階段，前炎癥因子TNF-α可大量持續(xù)釋放至局部組織和血液中，可強烈激活胸腺細胞中的信號通路p38 MAPK，誘導多種細胞因子的釋放。Sen等[19]進一步深入研究發(fā)現(xiàn)組織細胞損傷后活化的p38 MAPK激活的信號轉導通路又會繼續(xù)產生大量前炎性因子TNF-α，進一步又推動p38 MAPK信號通路的活化，形成“瀑布效應”即正反饋循環(huán)。目前實驗資料均證實[20-23]TNF-α與慢性支氣管炎的發(fā)展有著緊密的關聯(lián)，其機制可能為TNF-α通過激活信號通路p38 MAPK，產生級聯(lián)反應激活中性粒細胞，致中心粒細胞大量趨化、黏附、集聚于氣道粘膜以及肺組織，加重慢性支氣管炎炎癥的進展。孫希[24]在研究隔藥餅灸改善大鼠慢支的實驗中也證實經治療后的大鼠肺組織和血清中TNF-α含量與模型組比較均降低，且呈正相關，提示隔藥餅灸改善了慢支大鼠的癥狀，減輕了炎癥反應，其機制為隔藥餅灸通過降低血清TNF-α濃度以及肺組織中的TNF-α蛋白表達減少其對p38 MAPK的激活，從而改善慢性支氣管炎炎癥的發(fā)生，成為防治慢性支氣管炎的重要機制之一。通過本實驗結果疏風宣肺湯組能明顯減少慢支模型大鼠血清中TNF-α濃度、肺組織中TNF-α mRNA的表達及TNF-α蛋白的表達，同時肺組織中p-p38 MAPK蛋白的表達亦降低，綜上所述大膽推測疏風宣肺湯可以明顯改善慢性支氣管炎患者的主要癥狀，具有明顯的臨床療效，可能是通過降低血清TNF-α濃度以及肺組織中TNF-α mRNA的表達及TNF-α蛋白含量，而減少對信號通路p38 MAPK的激活，實現(xiàn)慢支炎癥的控制。

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